生命学院李赛团队揭示Ad5-nCoV（“克威莎”）疫苗诱导免疫反应的分子机制

　　

世界卫生组织（WHO）已批准多种COVID-19疫苗用于紧急使用，这些疫苗基于多种平台，例如mRNA疫苗、灭活病毒疫苗、蛋白亚单位疫苗和腺病毒载体疫苗。大多数疫苗选择S蛋白或其RBD结构域作为免疫原，以刺激机体产生适应性免疫并建立长期免疫记忆。Ad5-nCoV（"克威莎"疫苗）是一种腺病毒载体疫苗，由军事科学院军事医学研究院陈薇院士团队及康希诺生物联合研发，已在十多个国家获批，并在COVID-19大流行期间向全球供应了超过1亿剂。2022年底，雾化吸入型Ad5-nCoV也在中国获批紧急使用，作为加强疫苗显示出良好的免疫原性，并在真实世界中证明了其预防感染的有效性。尽管Ad5-nCoV疫苗在临床试验中表现出良好的保护效果，但其高免疫原性和发挥作用的分子机制尚未完全阐明。

2025年3月19日，生命学院李赛课题组在《结构》（Structure）期刊发表了题为“Ad5-nCoV疫苗诱导免疫反应的分子基础”（Molecular basis of Ad5-nCoV Vaccine-Induced Immunogenicity）的研究工作。该研究通过冷冻电子断层扫描（cryo-ET）、荧光显微镜和质谱分析等技术，首次在分子层面揭示了两种Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白的结构、分布和糖基化修饰信息。研究还在细胞水平上进行了功能验证，为疫苗的优化和开发提供了重要的分子视角。

本项目研究了两种疫苗，分别编码了野生型新冠病毒S蛋白（Ad5-nCoV_Wu）和Omicron变异株+序列优化的S蛋白（Ad5-nCoV_O）。研究团队首先对Ad5-nCoV疫苗接种细胞后诱导的S蛋白进行了免疫荧光染色，对Ad5-nCoV腺病毒疫苗表达的S蛋白在细胞上的具体定位进行分析，确认了Ad5-nCoV疫苗诱导产生的S蛋白表达在细胞膜上。接着使用冷冻电子断层成像（cryo-ET）技术对接种疫苗后的细胞进行原位研究，在原位水平上观察到Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白密集地呈现在细胞膜上，并且主要以融合前构象（prefusion）存在。研究团队还观察到，接种Ad5-nCoV疫苗的细胞能分泌出由S蛋白包被的囊泡。原位cryo-ET捕捉到了S蛋白包被囊泡的分泌过程中分别存在于细胞内部与细胞外部的状态（图1）。这些由S蛋白包被的囊泡可以随着体液运输扩大免疫范围。

图1：Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白冷冻电子断层图像

团队在细胞水平的研究中发现，Ad5-nCoV_Wu疫苗诱导的S蛋白在细胞膜上能够介导细胞间融合，形成合胞体，而Ad5-nCoV_O疫苗由于2P突变和S1/S2切割位点的删除，显著减少了合胞体的形成，表明这些突变有效稳定了S蛋白的前融合构象，防止了细胞间融合的发生（图2）。

图2：Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白在细胞膜上的分布及合胞体形成

通过子断层平均（sub-tomogram averaging）方法，团队解析了S蛋白的原位结构。发现其结构与天然SARS-CoV-2病毒上的S蛋白高度相似，S蛋白结构完整且RBD结构域具有灵活抬起和落下的特性（图3）。

图3：Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白原位结构

为了在原位水平上验证Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白的免疫原性，团队使用特异性识别S蛋白的抗体对接种Ad5-nCoV_O疫苗的细胞进行孵育并进行免疫荧光观察及cryo-ET数据收集。在原位上发现Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白可以被抗体识别并结合，具有良好的免疫原性（图4）。

图4：Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白的免疫原性验证。断层图像中红色标注为细胞表面的S蛋白密度，蓝色标注为识别S蛋白的抗体密度。

此外，团队通过质谱分析，详细解析了Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白的糖基化修饰。研究发现，Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白的糖基化模式与天然SARS-CoV-2病毒上的S蛋白高度相似，尤其是Omicron株S蛋白的糖基化更为成熟，复杂型糖基化比例更高。这些糖基化修饰不仅有助于S蛋白的正确折叠，还可能影响其免疫原性，进而影响疫苗的保护效果（图5）。

图5：Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白的糖基化修饰

本研究通过使用cryo-ET技术，揭示了Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白的结构特征，发现疫苗能够高效诱导S蛋白的表达，并且这些S蛋白具有高度的结构完整性和免疫原性。这些发现为理解疫苗如何通过细胞呈递抗原至细胞膜，并传递抗原至体内从而激活免疫系统的过程提供了原位水平的视角。在细胞水平上对Ad5-nCoV疫苗引发的合胞体现象的研究，为疫苗的接种策略优化提供了建议。然而，Ad5-nCoV疫苗诱导的S蛋白的具体免疫机制，尤其是其与中和抗体的结合机制、疫苗诱导的后续免疫反应的分子机制等，是下一步的研究重点。

清华大学生命学院、北京生物结构前沿研究中心、清华-北大生命联合中心、膜生物学国家重点实验室李赛副教授为本研究的通讯作者。清华大学生命学院2020级博士研究生董冬阳和博士后宋雨桐为本研究的共同第一作者。另外，李赛课题组2020级博士研究生彭程、2023级博士研究生张伟平、2021级博士研究生孔维正、科研助理张哲源、2023级博士研究生宋静雯参与了部分工作。军事科学院军事医学研究院研究员侯利华、吴诗坡与副研究员王步森为项目提供了腺病毒载体疫苗和宝贵的科学建议。

本工作得到了国家蛋白质科学研究（北京）设施清华基地冷冻电镜平台、生物计算平台、细胞影像平台和公共生物安全二级实验平台的技术支持。同时，本研究得到了国家自然科学基金、清华大学春风基金、清华大学笃实基金、清华-北大生命联合中心、北京生物结构前沿研究中心、膜生物学国家重点实验室等支持。特别感谢雷建林博士、杨帆博士、李晓敏博士在冷冻电镜数据采集方面提供的帮助；感谢刘冰钰博士、李静博士在荧光成像方面提供的帮助；感谢邓海腾博士、田晓林博士在质谱样品处理及分析方面提供的帮助。

原文链接：

https://www.cell.com/structure/fulltext/S0969-2126(25)00062-0