新型实时环介导等温扩增（rt-LAMP）检测技术助力肺结核早期诊断

《Scientific Reports》：Validation study of a novel, rapid, open platform real-time LAMP assay for early diagnosis of pulmonary tuberculosis

为解决肺结核诊断难题，印度研究人员开展新型 rt-LAMP 检测技术研究，结果显示该技术灵敏度和特异性高，对肺结核早期诊断意义重大。

　　

肺结核诊断困境与新型检测技术的探索

肺结核（Tuberculosis，TB）是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的高传染性疾病，全球近 18 亿人感染，严重威胁公共健康。在众多传染病中，肺结核的诊断面临诸多挑战。与 HIV、疟疾等疾病不同，目前缺乏简单、快速且价格亲民的检测方法。世界卫生组织（WHO）指出，由于快速诊断检测的可及性不足，仅有 71% 的新感染病例被报告。新冠疫情更是雪上加霜，使肺结核的诊断和治疗遭受重创，2021 年新增病例和死亡人数均有所上升，发病率也出现逆转，终止结核病流行的目标面临巨大阻碍。

现有的核酸扩增技术在诊断肺结核时，难以兼顾简单性和可负担性，无法满足 WHO “终止结核病” 战略的需求，尤其对于低收入和中等收入国家（LMICs）而言。在这种背景下，为了寻找更有效的诊断方法，印度 Sree Chitra Tirunal 医学科学与技术研究所的研究人员开展了一项关于新型实时环介导等温扩增（real-time Loop-mediated Isothermal Amplification，rt-LAMP）检测技术的研究，相关成果发表在《Scientific Reports》上。

研究方法：多技术结合构建检测体系

研究人员为了评估 rt-LAMP 检测技术的诊断性能，采用了多种关键技术方法。样本来自印度喀拉拉邦特里凡得琅州结核病示范和培训中心的 350 例疑似肺结核患者，收集其痰液样本进行检测。以 MGIT 培养作为微生物学参考标准（Microbiological Reference Standard，MRS），同时进行痰涂片显微镜检查、Xpert MTB/RIF 检测和 rt-LAMP 检测。

在 rt-LAMP 检测技术中，针对结核分枝杆菌的 mpt64 基因设计引物，通过等温扩增技术在特定温度下进行反应，并利用荧光染料实时监测反应过程。此外，通过构建重组 mpt64 质粒作为阳性对照，进行系列稀释确定检测限，以此全面评估 rt-LAMP 检测技术的性能。

研究结果：rt-LAMP 展现良好诊断性能

1. 优化与检测限：研究对 rt-LAMP 检测技术进行优化，结果显示该技术能在 10 - 20 分钟内实现强劲的指数扩增，且 ΔRn 值较高。通过对 pL-mpt64 质粒进行系列稀释检测，发现 rt-LAMP 检测技术的最低检测限为 10 拷贝 /μl，并且在检测范围内呈现良好的浓度依赖性线性关系。
2. 分析灵敏度和特异性：在 350 例参与者中，男性占 63%，女性占 37%，年龄范围为 15 - 85 岁，中位年龄 53 岁。与 MRS 相比，rt-LAMP 检测技术的灵敏度为 89.36%（95% 置信区间 76.9 - 96.45%），特异性为 94.06%（95% 置信区间 90.77 - 96.44%）；与 Xpert MTB/RIF 相比，其灵敏度高达 93.33%（95% 置信区间 83.80 - 98.15%），特异性为 98.62%（95% 置信区间 96.51 - 99.62%），阴性预测值为 98.62%（95% 置信区间 96.52 - 99.47%），阳性预测值为 93.33%（95% 置信区间 84.07 - 97.38%）。Youden 指数为 0.91，表明假阳性率较低。
3. 与其他检测方法比较：通过逻辑回归分析，以 MRS 为金标准，发现 Xpert MTB/RIF 和 rt-LAMP 的曲线下面积（AUC）分别为 0.905 和 0.917，二者检测准确性相近，但 rt-LAMP 在灵敏度和特异性上略高于 Xpert MTB/RIF。而痰涂片检测的灵敏度仅为 59.97%（95% 置信区间 44.27 - 73.63%），特异性为 95.38%（95% 置信区间 92.37 - 97.45%），明显低于 rt-LAMP 和 Xpert MTB/RIF。

研究结论与讨论：新型技术的优势与挑战

研究表明，新开发的 rt-LAMP 检测技术对肺结核的早期诊断具有高特异性和高灵敏度，Youden 指数达 0.92，显示出强大的判别能力。与日本 Eikon 公司的 TB - LAMP 相比，rt-LAMP 检测技术灵敏度更高，且能提供更多数据点，便于区分非特异性扩增。

作为一种开放平台系统，rt-LAMP 检测技术可在等温荧光读取器或任何可编程的定量聚合酶链反应（qPCR）机器上运行，通量高，检测效率显著提升。然而，该技术在实施过程中也面临挑战，如需要单独的 DNA 提取程序，对设备和操作人员要求较高。但鉴于其成本效益高、准确性好的特点，可以作为肺结核筛查的首选方法，减轻 Xpert MTB/RIF 等昂贵检测方法的负担，优化疾病控制项目。

总体而言，rt-LAMP 检测技术为肺结核的早期诊断提供了一种新的有力工具，尤其在资源有限的低收入国家，有望大幅提高肺结核的检测效率，助力全球结核病防控工作，对实现 WHO “终止结核病” 战略目标具有重要意义。