新型 3D 打印灌注生物反应器：开启复杂细胞培养模型研究新征程

《Scientific Reports》：Fabrication of a novel 3D-printed perfusion bioreactor for complex cell culture models

为解决传统骨髓微生理系统（MPS）的不足，研究人员开发新型 3D 打印灌注生物反应器（3D-PBR），发现其利于细胞培养与分化，推动相关研究。

　　

研究背景：挑战中探寻突破

在生命科学的微观世界里，细胞的培养与研究是探索人体奥秘的关键钥匙。近年来，微生理系统（MPS），也就是大家熟知的 “器官芯片” 技术蓬勃发展，让科研人员能在小小的芯片上构建各种组织和器官模型，模拟人体生理环境，为疾病研究和药物研发带来了新希望。其中，骨髓（BM）微环境的研究备受关注，它对调节造血和骨生成至关重要，在体外构建类似的微环境，有助于深入了解血细胞发育、免疫反应以及骨组织的平衡，还能为白血病、贫血和骨相关疾病的研究提供重要线索。

然而，现有的骨髓 MPS 存在诸多难题。多数基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的设备，虽然应用广泛，但问题不少。比如，其制造过程繁琐，需要耗费大量人力；分子吸收现象严重，实验中的物质容易扩散到 PDMS 结构中，影响实验结果的准确性；而且修改设计时限制很大，每次更改都要重新制作模具，效率低下。其他材料，像聚碳酸酯（PC）和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），也因为采用层叠制造方法，存在类似的问题。此外，一些复杂的设计，如生物打印的自然萌芽血管系统，在测量和成像方面困难重重，使得简单的两室模型仍占据主导地位。在这样的困境下，科研人员迫切需要一种新的技术，来突破这些限制，更精准地模拟骨髓微环境，深入研究细胞的奥秘。

研究团队与研究内容：创新技术开辟新径

为了攻克这些难题，来自美国洛斯阿拉莫斯国家实验室（Los Alamos National Laboratory）等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们致力于开发一种新型的 3D 打印灌注生物反应器（3D-PBR），希望通过这一创新设备，实现人体骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）的原位生长和分化，并能与血管细胞进行共培养。

研究人员运用了多种先进技术来打造这个 “细胞家园”。首先，在生物反应器的设计和制造上，他们使用生物相容性树脂基聚合物进行 3D 打印，构建出两个独特的 3D 打印隔室，中间用 0.4μm 直径的多孔聚对苯二甲酸乙二酯（PET）膜连接，分别模拟骨髓的血管和间充质基质（MS）隔室。制造过程也十分精细，从 3D 绘图软件设计模型，到使用特定的 3D 打印机打印，再到经过多次清洗、固化、激光切割和组装，每一步都严格把控，确保生物反应器的质量和性能。其次，通过微 CT 扫描来精确测量 3D-PBR 的内部尺寸，评估其结构的准确性。在细胞培养方面，他们分别对 MSCs 和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行 2D 细胞扩增，再将 MSCs 悬浮在胶原 - 纤维蛋白凝胶中，在 3D-PBR 中诱导其向脂肪细胞或成骨细胞分化，同时在特定阶段添加 HUVECs，构建共培养体系。最后，运用免疫组化染色、荧光成像、细胞活力测量和细胞形态分析等多种技术，全面评估细胞在 3D-PBR 中的生长、分化和相互作用情况。

研究结果：细胞培养的新突破

1. 细胞活力：通过吖啶橙 / 碘化丙啶（AO/PI）染色测量细胞活力，发现 MSCs 和 HUVECs 在 3D-PBR 中的存活率较高，在连续 4 天的测量中，MSCs 的平均存活率为 92%，HUVECs 为 91%，且不同天数间的存活率差异不显著，这表明 3D-PBR 具有良好的生物相容性。
2. 免疫组化分析
   • 成骨分化：在成骨分化实验中，将 MSCs 在静态 3D 培养和 3D-PBR 环境中分别用成骨分化培养基培养 21 天。免疫组化结果显示，静态 3D 环境中的 MSCs 主要呈现纺锤形，类似未分化状态；而在 3D-PBR 中培养的 MSCs，成骨成熟度更高，其细胞的圆度和树突状延伸长度明显不同。通过细胞形态分析发现，两者在圆度和偏心率上差异显著（p<0.0001），3D-PBR 中细胞的平均紧密度比静态培养低 8%（p=0.0034），这表明 3D-PBR 更有利于 MSCs 向成骨细胞分化。
   • 脂肪分化：对于 MSCs 的脂肪分化，在 3D-PBR 和静态 3D 培养板中分别用脂肪分化培养基培养 21 天。免疫组化染色结果显示，两种培养条件下都能观察到不同程度的脂肪细胞成熟，但在分化的脂肪细胞百分比上，两者无显著差异（p=0.9294）。不过，3D-PBR 中含有更多直径大于 20μm 的脂滴，导致其脂滴的平均荧光强度更高（p<0.0001），这说明 3D-PBR 在脂滴成熟阶段可能有促进作用。
   • HUVECs 的培养：在 MSCs 分化为成骨细胞或脂肪细胞后，向 3D-PBR 中添加 HUVECs，在两种不同流速下培养 4 天。结果发现，与静态 2D 培养相比，3D-PBR 中 HUVECs 能形成更明显的粘附连接，细胞形态也有所不同，呈现出拉伸的肌动蛋白丝和更强的粘附连接信号，且在 4 天内对已分化的 MSCs 形态影响不大。

研究结论与讨论：前景光明但仍需探索

研究人员成功制造并维持了基于 3D 打印技术的动态 3D 组织微环境，用于 MSCs 的原位生长和分化，并实现了与血管细胞的共培养。这一成果意义重大，3D-PBR 克服了传统 PDMS 设备的诸多缺点，如分子吸收、耐久性差等，其制造过程简单，使用的材料都是行业标准材料，无需定制修改，还能实现快速流体连接，有助于推动微生理系统在生物科学研究中的标准化应用。同时，研究表明 3D-PBR 能促进 MSCs 向成骨细胞和脂肪细胞分化，且在脂滴成熟和 HUVECs 的培养方面表现出色，为研究细胞分化、血管化和组织微环境的机械生物学效应提供了有力工具。

然而，这项研究也存在一些局限性。一方面，虽然 3D-PBR 实现了多种细胞的共培养，但没有通过详细的基因表达分析来量化血管细胞产生的血管生成因子对 MSCs 生长和分化的影响。另一方面，由于不同细胞需要特定的培养基，研究中血管细胞是在 MSCs 分化后才添加的，未来需要开发一种通用培养基，以便同时培养和分化所有细胞类型，并结合分子尺度的分析方法，如聚合酶链反应（PCR），来进一步提高研究的生理相关性。

总的来说，这项研究为 3D 打印技术在细胞培养领域的应用开辟了新道路，为深入理解 MSCs 的谱系定向和骨髓微环境的奥秘提供了重要依据。随着研究的不断深入和技术的持续改进，3D-PBR 有望在基础生物学研究和临床应用中发挥更大的作用，为攻克更多的生命科学难题贡献力量。这篇研究成果发表在《Scientific Reports》上，为该领域的研究提供了宝贵的参考。