A stable NTN1 fluorescent reporter chicken reveals cell specific molecular signatures during optic fissure closure

为探究视神经裂闭合（OFC）机制，罗斯林研究所研究人员构建 NTN1-T2A-eGFP 鸡系，发现新标记和通路，助力相关研究。

　　在生命的奇妙旅程中，胚胎发育是一场精密而复杂的 “演出”，其中细胞融合的过程至关重要，它就像搭建生命大厦的关键环节，一旦出现差错，各种发育性疾病便会 “乘虚而入”。在眼睛的发育过程中，视神经裂（Optic Fissure，OF）的闭合尤为关键。OF 是早期眼球腹侧的一道自然间隙，就像眼睛发育途中的一道 “关卡”，视网膜上皮细胞必须在此完美融合，才能塑造出正常的眼球结构。然而，当这一融合过程失败时，就会引发眼缺损（coloboma），这一病症不仅会影响眼部的外观，更严重的是会导致视力受损，给患者的生活带来极大困扰。

Netrin-1（NTN1）作为一种在胚胎发育中扮演多种重要角色的分泌蛋白，在 OF 闭合过程中，它如同一个精准的 “导航员”，特异性地在融合先锋细胞中表达。不过，尽管 NTN1 如此关键，但此前人们对它在 OF 闭合过程中的分子机制了解十分有限。为了深入揭开这一神秘面纱，来自英国罗斯林研究所（The Roslin Institute）等机构的研究人员展开了一项意义重大的研究，相关成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，借助 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，精准地将绿色荧光蛋白（eGFP）靶向插入到 NTN1 基因位点，成功构建了 NTN1-T2A-eGFP 鸡系；接着，利用光谱荧光细胞分选技术，从胚胎眼中高效分离出表达 GFP 的先锋细胞；最后，对这些细胞进行转录组分析，全面探究基因表达情况。

研究结果如下：

1. 构建并验证 NTN1-T2A-eGFP 鸡系：研究人员运用 CRISPR/Cas9 敲入策略，将 T2A 自切割肽和增强型 GFP 报告基因插入鸡 NTN1 基因座。经检测，该鸡系中 GFP 的定位忠实反映了内源性 NTN1 在视神经裂和神经管底板的表达。并且，NTN1^T2A-eGFP/+胚胎和孵化出的雏鸡表型均正常，这表明该鸡系可有效用于研究 NTN1 表达细胞。
2. 分离先锋细胞：由于鸡胚胎组织的单细胞解离方法不适用于 HH.28 期的腹侧鸡眼组织，且视网膜色素上皮（RPE）细胞会自发荧光干扰 GFP 阳性细胞的分选。为此，研究人员优化了解离方法，采用光谱分选 FACS 策略，成功从 NTN1^T2A-eGFP/+胚胎眼中分离出先锋细胞。
3. 先锋细胞转录组分析：对分离出的 GFP 阳性和阴性细胞进行转录组测序及分析后发现，共有 1701 个差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）。其中，GFP 阳性细胞中有 433 个 DEGs，包含已知的先锋细胞标记 NTN1 和 PAX2；GFP 阴性细胞中有 1268 个 DEGs，富含眼周间充质标记物。这一结果证实了分离的 GFP 阳性细胞确实为视神经裂先锋细胞。
4. 发现新的 OFC 候选基因：通过对先锋细胞特异性 DEGs 的分析，研究人员发现了多个此前未被报道与视神经裂闭合或眼缺损相关的基因，如 DVL1、GALNT6、FOXP2、CLYBL、ZIC1 和 EGF。这些基因在视神经裂先锋细胞区域特异性表达，且部分基因在融合过程中呈现出表达变化，提示它们可能在 OFC 中发挥重要作用。
5. 揭示新的信号通路：对 GFP 阳性 DEGs 进行基因本体（Gene Ontology，GO）分析和 STRING 富集分析，发现 HGF/MET 和 PI3K/AKT 相关信号通路可能在鸡先锋细胞融合过程中被激活。进一步实验证实，MET 和 HGF 在视神经裂的表达具有时空特异性，且在融合阶段，磷酸化的 MET 受体蛋白在先锋细胞中存在活性，表明 HGF/MET 通路在 OFC 中具有重要作用。

研究结论和讨论部分指出，本研究成功构建了稳定的 NTN1 荧光报告鸡系，这一工具不仅为研究 NTN1 在胚胎发育中的功能提供了有力支持，还首次对 OFC 过程中的先锋细胞进行了直接分子特征分析。研究发现的多个新的 OFC 标记和通路，为深入理解胚胎组织融合和眼缺损的发病机制奠定了基础。此外，鉴于 NTN1 在其他组织发育和疾病中的广泛表达，该鸡系还可用于研究其他组织中 NTN1 表达细胞的生物学特性，具有广阔的应用前景。这项研究为生命科学和医学领域在胚胎发育、眼部疾病研究方面提供了重要的理论依据和研究工具，有望推动相关领域的进一步发展。