PHluorin 标记的二级纳米抗体：解析突触囊泡胞吐与胞吞的创新工具

《Scientific Reports》：PHluorin-conjugated secondary nanobodies as a tool for measuring synaptic vesicle exocytosis and endocytosis

为解决现有突触囊泡标记工具的局限性，研究人员开展 2ndpHluorin 工具研究，结果显示其能有效分析囊泡循环，意义重大。

　　在神经科学的微观世界里，神经元之间的交流就像一场精密的 “信号舞会”，而这场舞会的关键 “舞者” 之一便是突触囊泡。神经元通过突触囊泡的循环来传递神经递质，实现信息交流，这一过程就像快递员在神经元之间传递包裹，对神经系统正常运作至关重要。一直以来，科学家们都渴望揭开这个过程的神秘面纱，于是开发了多种成像工具来进行研究。

早期的 FM 染料就像带着模糊 “滤镜” 的观察工具，它虽能标记突触囊泡，但激发和发射光谱较宽，在多色成像实验中容易 “串色”，影响观察效果。而且它亮度和光稳定性较差，就像一个电量不足的手电筒，在长时间的实时成像中难以提供清晰的画面。此外，使用 FM 染料还需要长时间清洗，这个过程不仅繁琐，还可能导致囊泡标记丢失，甚至它还会与各种受体相互作用，干扰实验结果，就像一个捣乱的 “小怪兽”，让实验结果变得复杂难测。

相比之下，基因编码的 pHluorins 则像是定制的 “高科技追踪器”，它能被神经元的分泌系统包装进囊泡，避免了染料摄取的问题，而且能通过对 pH 变化的响应来报告囊泡的胞吐和胞吞过程。不过，它也有自己的 “小毛病”，使用时需要向神经元中引入外源遗传物质并使其表达，这就像给神经元 “安装” 一个复杂的 “插件”，实验操作繁琐，对实验条件要求也很高。

还有一类针对突触结合蛋白 1（synaptotagmin 1，Syt1）腔面结构域的抗体，它能特异性标记突触囊泡，不需要复杂的清洗步骤，也不会受其他类型囊泡的干扰。但它却无法报告囊泡的胞吐过程，就像一个 “哑巴快递员”，能把包裹送到，但无法告知包裹何时被送出。

为了解决这些问题，来自德国哥廷根大学医学中心神经与感觉生理学及神经退行性疾病生物结构成像（BIN）中心的研究人员 Svilen V. Georgiev 和 Silvio O. Rizzoli 开展了一项研究。他们设计了一种新工具 —— 由抗 Syt1 腔面结构域的一级抗体和携带 pHluorin 基团的二级单域抗体（纳米抗体）组成的 2^ndpHluorin。这项研究成果发表在《Scientific Reports》上，为神经科学研究带来了新的曙光。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。首先，他们制备了原代大鼠海马神经元培养物，这就像是搭建了一个神经元的 “小舞台”，为后续实验提供了场所。然后，通过将小鼠抗 Syt1 抗体与定制的单域骆驼抗体（纳米抗体）结合，构建了 2^ndpHluorin 这一特殊的标记工具。在实验中，利用电刺激神经元的方式模拟神经元活动，同时运用活细胞成像技术观察突触囊泡的动态变化，就像给突触囊泡的活动过程拍了一部 “微观纪录片”。最后，借助 Matlab 和 GraphPad Prism 等软件进行数据分析，从 “纪录片” 中提取关键信息。

在研究结果方面，研究人员发现 2^ndpHluorin 成功报告了突触囊泡的胞吐过程。当改变细胞培养液的 pH 时，2^ndpHluorin 标记的突触囊泡能做出相应的荧光强度变化，就像一个灵敏的 “荧光小卫士”，能准确感知 pH 变化。在不同的电刺激模式下，2^ndpHluorin 都能有效响应。无论是短时间刺激（8 - 80 个动作电位，APs）时从易释放池中检测到的胞吐事件，还是长时间刺激（200 - 800 个 APs）时从回收池中检测到的胞吐，它都能 “精准定位”，甚至还能标记储备池中的囊泡，让科学家们对不同囊泡池的活动有了更清晰的认识。而且，通过设计特定的刺激实验，研究人员发现 2^ndpHluorin 能有效标记不同的突触囊泡池，其中约 40% 的标记囊泡属于储备池，这与之前的研究结果相吻合。

在与现有的标记方法进行对比时，研究人员发现 2^ndpHluorin 在标记效率和检测动态范围上更具优势。与转染了突触素 - mOrange2（mOr2 - sypHy）的神经元相比，2^ndpHluorin 能标记更多的突触，并且在检测突触囊泡胞吐事件时更灵敏，就像一个 “超级放大镜”，能看到更多的细节。此外，2^ndpHluorin 在多次刺激和长时间孵育实验中表现稳定，即使经过多次刺激或长时间孵育，它依然能可靠地检测囊泡的动态变化。

在研究结论和讨论部分，2^ndpHluorin 展现出了强大的性能，它能有效监测突触囊泡动力学，标记不同的囊泡池，适用于多种实验条件，在研究突触囊泡循环方面具有极大的优势。不过，它也存在一些挑战，比如需要预孵育，且标记的突触囊泡比例有限。但这并不影响它成为研究突触囊泡动力学的重要工具，为后续深入研究神经元之间的信息传递机制提供了新的手段，就像为神经科学研究打开了一扇新的大门，让科学家们能更深入地探索神经系统的奥秘，有望为神经相关疾病的研究和治疗带来新的思路和方法。