合成对照样本助力宏转录组临床检测：突破困境，开启精准诊断新篇

《Scientific Reports》：Preparation of robust synthetic control samples and their use in a metatranscriptomic clinical test

为解决宏转录组（MT）诊断缺乏合适对照材料的问题，研究人员开发合成对照（SC）样本，其性能良好，有望推动 MT 检测应用。

　　在现代医学的发展进程中，精准诊断是有效治疗疾病的关键。宏转录组（MT）作为一种前沿的分析方法，能够对样本中所有生物体的转录本进行全面分析，为多种慢性和传染性疾病的筛查与诊断提供了强大的平台。通过 RNA 测序技术，MT 可生成大量转录组数据，帮助科学家们识别基因突变、检测感染病原体、探究人类基因表达谱在健康与疾病中的作用，以及揭示各种人类微生物组对慢性病的影响。例如，MT 已成功应用于口腔和咽喉癌、2 型糖尿病、肠易激综合征和自闭症谱系障碍等疾病的诊断。

然而，MT 诊断技术在临床应用中面临着一个严峻的挑战 —— 缺乏合适的对照材料。与定量 PCR 或扩增子测序等靶向诊断方法不同，MT 诊断模型通常利用机器学习来识别数百个与疾病相关的分子特征。对于靶向方法，可通过引入特定突变或感兴趣的基因来轻松制备阳性或阴性对照材料，但 MT 疾病模型的信号复杂，难以采用相同方式制备对照。目前，传统的测序对照材料主要来源于已知疾病状态的患者，样本收集困难且数量有限，这不仅增加了后勤负担，还导致检测结果的变异性较大，限制了高通量临床实验室的操作，阻碍了 MT 诊断测试的广泛应用。

为了攻克这一难题，来自美国 Viome Research Institute 和 Viome Life Sciences, Inc. 的研究人员展开了深入研究。他们开发了一种全新的方法，用于生成合成对照（SC）样本，这些样本能够复制复杂临床标本的核酸特征，并产生预期的测试结果。相关研究成果发表在《Scientific Reports》上，为 MT 诊断领域带来了新的希望。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，从临床确诊的口腔癌患者唾液样本中提取总 RNA，经 DNase 处理降解 DNA 后，去除人类和微生物核糖体 RNA，将剩余转录本转化为 cDNA，并添加 PCR 引物退火接头。随后，通过 PCR 扩增 cDNA，利用带有 T7 启动子序列的正向引物和特定反向引物进行体外转录，获得 SC RNA。为评估样本性能，研究人员对样本进行多次扩增和转录，并通过 CancerDetect 测试（一种临床验证且获得许可的口腔和咽喉癌筛查测试）对样本进行分析。此外，研究人员还利用自定义参考目录，通过 Centrifuge 进行分类学分类，并采用期望最大化（EM）算法估算样本中微生物的表达水平。

研究结果如下：

• SPC 指标：通过 CancerDetect 测试确认两名患者样本为口腔或咽喉癌阳性，预测的 OC 风险评分分别为 0.99（SPC_1 供体）和 0.89（SPC_2 供体）。将阳性样本转化为 SPC 后，F0 产生的 dsDNA 模板可用于多次 PCR 反应，每次反应能生成大量 SPC RNA，证明该方法具有良好的可扩展性。同时，随着 PCR 循环次数增加，% Microbial ESD 显著降低，推测可能是由未知成分的 PCR 产物导致。
• SPC OC 风险评分与扩增循环数的关系：尽管 SPC_1 和 SPC_2 的 OC 风险评分在 F0 至 F3 之间无显著差异（p>0.05），但随着扩增循环数增加，风险评分呈下降趋势。这表明 SPCs 最多再进行一轮 PCR（至 F1），可最大程度减少阳性信号的降解。不过，不同测试情况可能有所不同。
• SPC OC 风险评分与不同人群的关系：所有 SPCs（SPC_1 F0 - F3 和 SPC_2 F0 - F3 合并数据）与普通人群相比，阳性信号显著增强（p<0.001）。这说明即使经过多次 PCR 扩增，SPCs 仍能产生强劲的阳性信号。
• SPC 在临床测试中的应用：SPCs 在临床实验室的口腔和咽喉癌筛查测试（CancerDetect）中进行应用，对 124 个 SPC RNA 样本（SPC_1 F1）分析数月后发现，平均 SPC OC 风险评分为 0.996，所有重复样本的变异系数为 0.29%。这表明 SPCs 在临床测试中表现可靠，能产生预期的阳性结果。

综上所述，研究人员开发的合成对照样本（SCs）为宏转录组诊断测试提供了一种稳定、可靠且经济高效的对照材料。SCs 的优势在于其稳定性、鲁棒性和低成本，即使经过多次 DNA 模板扩增，仍能保持阳性信号的稳定，减少对患者样本的依赖，可在临床实验室大规模生产。此外，SPCs 已成功应用于口腔和咽喉癌的临床筛查测试，验证了其在实际临床应用中的可行性和有效性。然而，该研究也存在一定局限性，目前仅在一种临床测试和两种癌症检测中验证了该方法的实用性，未来需在更多疾病检测中进行验证。同时，SCs 的制备方法有望应用于其他下一代测序（NGS）分子生物学诊断技术，如宏基因组学和扩增子测序等领域，为这些技术提供更优质的对照材料，推动分子诊断技术的进一步发展。这一研究成果为 MT 诊断技术在临床实践中的广泛应用奠定了坚实基础，有望改善疾病诊断的准确性和效率，为患者提供更及时、有效的治疗方案，在生命科学和健康医学领域具有重要的意义和广阔的应用前景。