ChIPbinner：解析宽组蛋白标记的创新利器，开启表观遗传研究新视野

《BMC Bioinformatics》：ChIPbinner: an R package for analyzing broad histone marks binned in uniform windows from ChIP-Seq or CUT&RUN/TAG data

为解决现有软件分析宽组蛋白修饰（PTMs）信号时的局限，研究人员开展 ChIPbinner 软件相关研究，结果显示其能更精准识别差异结合区域，为表观遗传研究提供新工具。

　　在生命科学的微观世界里，组蛋白修饰如同隐藏在基因密码背后的神秘 “开关”，掌控着基因的表达，进而影响生物的各种生理过程。组蛋白修饰，是指对包裹 DNA 的核小体中组蛋白尾巴进行的化学修饰，这些修饰被称为组蛋白标记，它们能通过促进或阻碍对 DNA 的访问来调节基因表达。比如，狭窄的组蛋白标记，像组蛋白 H3 赖氨酸 27 的乙酰化（H3K27ac），会沉积在特定的基因组区域；而宽组蛋白标记，如组蛋白 H3 赖氨酸 36 的甲基化（H3K36me），则在基因组中广泛分布，覆盖大片区域。

随着测序技术成本的降低，以及人们对驱动疾病的表观遗传机制理解的加深，染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）、切割并释放使用核酸酶测序（CUT&RUN）和切割并标记测序（CUT&TAG）等用于绘制蛋白质 - DNA 相互作用（例如组蛋白标记）的技术，在生物医学研究中的应用越来越广泛。然而，现有的分析工具，尤其是峰值调用软件，在处理宽组蛋白标记的弥漫、宽泛信号时却困难重重。像基于模型的 ChIP-Seq 分析（MACS），原本是用于检测转录因子结合位点的，但在检测覆盖大片基因组区域的弥漫性富集时，常受到高噪声水平和测序覆盖度不饱和的困扰。虽然也有针对宽组蛋白标记的峰值调用工具，如 EPIC2、MACS 的 “--broad” 功能和用于 CUT&RUN 的稀疏富集分析（SEACR）等，但不同工具对真正的信号富集判断存在差异，而且弥漫的宽区域还会被分割成小的、往往没有生物学意义的峰值。此外，当染色质修饰的基因组分布性质发生变化时，情况更加复杂，例如小儿胶质瘤中的 H3K27M 突变会使 H3K27me₃从宽分布变为启动子聚焦分布，不同酶沉积的 H3K36me₂也存在宽窄差异，这使得统一的比较分析方法难以应用 。

为了解决这些问题，来自麦吉尔大学（McGill University）的研究人员 Reinnier Padilla、Eric Bareke、Bo Hu 和 Jacek Majewski 开展了一项研究，相关成果发表在《BMC Bioinformatics》杂志上。他们开发了一个名为 ChIPbinner 的开源 R 软件包，专门用于对宽 PTMs 进行无参考依赖的分析。

研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。首先，将 ChIP-Seq 或 CUT&RUN/TAG 数据以均匀窗口分箱并转换为 BED 格式作为输入数据。然后，使用 DESeq2 的中位数比率法或 edgeR 的修剪均值 M 值（TMM）法对原始读取计数进行归一化处理，还可选择排除 ENCODE 黑名单区域的伪影信号和低原始读取计数的箱。此外，利用基于密度的层次聚类方法 HDBSCAN 来识别行为相似的箱的聚类，并使用可重复性优化测试统计（ROTS）方法进行差异结合分析。

研究结果如下：

• 模拟 ChIP-Seq 数据集：研究人员创建了模拟数据集，对 ChIPbinner 和 csaw 进行详细的性能比较。结果显示，在检测 H3K36me₂和 H3K4me₁时，ChIPbinner 的精度显著高于 csaw，F1 分数也更高。这是因为 csaw 在模拟的下采样样本中错误识别了上调的箱，将其归类为假阳性，而 ChIPbinner 能更准确地识别差异结合区域。
• 案例研究：研究人员以头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系 Cal27 中 NSD1 基因敲除（NSD1-KO）后 H3K36me₂的变化为例进行研究。ChIPbinner 识别出一个名为 Cluster B 的箱簇，该簇在野生型细胞系（WT）中 H3K36me₂水平高，而在 NSD1-KO 细胞系中水平低。相比之下，csaw 检测到的 H3K36me₂丢失区域较少，且报告了大量错误的上调箱。进一步分析发现，Cluster B 主要位于基因间区域，富集增强子，并且与 H3K27ac 结合减少，导致同一拓扑相关结构域（TAD）内的靶基因下调。此外，研究人员还用 ChIPbinner 在其他细胞系中研究了 H3K9me₃等宽组蛋白标记的变化，同样取得了有意义的结果。

研究结论和讨论部分指出，ChIPbinner 为研究人员提供了一种分析表观遗传数据趋势和模式的无偏工具，尤其适用于宽组蛋白标记的研究。它改进了先前的软件，提供了独立于差异结合（DB）状态的聚类方法，能更精确地识别宽组蛋白标记的差异结合区域，还具备用于下游分析的额外功能。在基因组中宽组蛋白标记分布或水平发生重大变化的情况下，如 NSD1-KO 导致 H3K36me₂变化，ChIPbinner 能有效探索不同条件下染色质修饰的差异，帮助研究人员分析宽组蛋白标记在基因间和基因区域的分布变化，且不受峰值调用工具或固定统计模型的假设和限制。这一研究成果为表观遗传学研究提供了新的有力工具，有助于深入理解疾病发生发展的表观遗传机制，推动生物医学领域的进一步发展。