仿生基因递送系统联合细胞外囊泡封装 AAV：改善糖尿病伤口愈合的新策略

《Journal of Nanobiotechnology》：Biomimetic gene delivery system coupled with extracellular vesicle–encapsulated AAV for improving diabetic wound through promoting vascularization and remodeling of inflammatory microenvironment

为解决 AAV 在慢性伤口中递送效率低的问题，研究人员开展 VEGF-EV-AAV/MSC-Exo@FHCCgel 的研究，发现其可促进血管生成等，对糖尿病伤口愈合意义重大。

　　

糖尿病伤口愈合的新希望：仿生基因递送系统的创新突破

在人体的防御体系中，皮肤就像一道坚固的城墙，保护着身体免受外界病原体的侵袭，维持着身体的稳定状态。然而，对于糖尿病患者来说，这道城墙却变得脆弱不堪。糖尿病引发的一系列问题，破坏了皮肤的正常结构和功能，使得伤口愈合变得异常艰难。正常的伤口愈合过程就像一场有序的交响乐，止血、炎症、增殖和重塑等阶段紧密配合，但糖尿病却打乱了这个节奏。其中，血管生成和炎症反应的失衡是关键问题，过度的炎症会导致血管生成异常，伤口难以愈合。

血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）在伤口愈合中起着至关重要的作用，它就像是血管生成的 “指挥官”，能促进内皮细胞增殖，加速肉芽组织形成，对伤口修复意义重大。因此，提高伤口微环境中 VEGF 的表达成为促进慢性伤口愈合的关键。随着基因工程的发展，基因治疗为解决这一问题带来了新的希望。腺相关病毒（Adeno - associated virus，AAV）作为一种有潜力的基因递送载体，具有安全性高、毒性低等优点，然而在慢性伤口的炎症微环境中，AAV 却面临着抗体中和导致的载体损失和基因转移效率受损等困境，这大大限制了其在临床治疗中的应用。

为了突破这些难题，南方医科大学南方医院烧伤科等机构的研究人员开展了深入研究。他们成功构建了一种仿生基因递送系统 VEGF-EV-AAV/MSC-Exo@FHCCgel，为糖尿病伤口愈合带来了新的曙光。该研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》杂志上。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。通过碘克沙醇超速离心技术从培养的 HEK 293T 细胞中分离出富含 AAV 的细胞外囊泡（EV-AAVs）；制备了基于 F127 的热敏感水凝胶（FHCCgel）作为基因递送系统的支架；利用密度梯度超速离心、Western blot、qPCR、流式细胞术（Flow Cytometry，FC）、共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）等技术对相关指标进行检测和分析；建立糖尿病小鼠模型，开展体内实验评估基因递送系统对糖尿病伤口愈合的影响。

研究结果主要如下：

1. EV-AAVs 的纯化与特性：采用 15 - 60% 碘克沙醇密度梯度离心法成功分离出纯化的 EV-AAVs。通过多种检测手段证实，该方法有效去除了游离 AAV 的污染。与游离 AAV 相比，EV-AAV 的基因转移效率显著提高，这得益于其外膜与细胞膜的相似性，更易被细胞摄取。
2. VEGF-EV-AAV/MSC-Exo@FHCCgel 的特性：制备的热敏感水凝胶（FHCCgel）在 37°C 时可转变为凝胶状态，具有均匀多孔的三维网络结构。其降解周期在模拟生理条件下为 10 天，在模拟糖尿病伤口环境下为 14 天，且在体内可完全降解。该基因递送系统能同时保持生物活性和机械刚性，体内实验表明其转染效率较高。
3. 生物相容性评估：通过乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）检测、MTT 检测和 CCK-8 检测等实验表明，VEGF-EV-AAV/MSC-Exo@FHCCgel 对 HaCaT、HUVEC 和 L929 细胞无明显细胞毒性，对实验小鼠的重要器官也无明显损伤，血液学检测结果也证实其具有良好的生物安全性。此外，该凝胶还能促进细胞迁移和增殖。
4. 对内皮细胞的抗炎作用：VEGF-EV-AAV/MSC-Exo@FHCCgel 可缓解过氧化氢（H₂O₂）对内皮细胞线粒体的损伤，恢复线粒体功能。通过多种实验方法观察到，该凝胶能降低线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放率，减少氧化型线粒体 DNA（Ox-mtDNA）的产生和释放，从而减轻炎症反应。
5. 对巨噬细胞的调节作用：该基因递送系统可抑制巨噬细胞衰老，促进其吞噬凋亡细胞的能力（efferocytosis）。研究发现，它能抑制 cGAS-STING 通路的激活，减少衰老相关分泌表型（SASP）的产生，诱导巨噬细胞向抗炎的 M2 表型极化，从而改善炎症微环境。
6. 促进内皮细胞增殖和血管生成：在模拟炎症微环境下，VEGF-EV-AAV/MSC-Exo@FHCCgel 能显著促进内皮细胞的增殖和迁移。细胞划痕实验、EDU 检测等结果表明，该凝胶可上调内皮细胞中 VEGF 的表达，激活 PI3K/Akt 信号通路，增强细胞的抗凋亡能力。
7. 对糖尿病伤口愈合的促进作用：在糖尿病小鼠模型中，VEGF-EV-AAV/MSC-Exo@FHCCgel 治疗组的伤口愈合速度明显快于其他组，在第 10 天伤口几乎完全愈合。组织学分析显示，该组伤口的表皮和真皮层更厚，血管生成增加，胶原蛋白沉积更均匀有序，炎症反应减轻。
8. 重塑炎症微环境：体内实验证实，VEGF-EV-AAV/MSC-Exo@FHCCgel 可抑制伤口组织中 cGAS-STING 通路的表达，促进 MerTK 信号通路，增加 M2 表型巨噬细胞的浸润，同时促进调节性 T 细胞（Tregs）的浸润，提高抗炎因子的转录水平，有效重塑了炎症微环境，促进了伤口愈合。

研究结论和讨论部分指出，本研究成功开发了一种纯化的 EV-AAV，并构建了基于优化热敏感水凝胶的仿生基因递送系统。该系统能有效保护 VEGF-EV-AAV，使其高效转染内皮细胞，增强内源性 VEGF 的表达。体内外实验均证实，VEGF-EV-AAV/MSC-Exo@FHCCgel 的抗氧化效果优于其他对照组。它通过多种机制改善糖尿病伤口愈合，如减少 Ox-mtDNA 的释放、抑制 cGAS/STING 通路、促进巨噬细胞极化和 Tregs 浸润等。这一研究为将 EV-AAV 与组织工程相结合治疗糖尿病伤口提供了理论依据，其抗炎调节和血管再生的综合设计有望为慢性伤口的内源性修复提供新的策略，为糖尿病伤口的临床治疗开辟新的方向。