靶向 DNA 诱导 SPARDA 复合物丝状形成与核酸酶激活机制研究：细菌防御与核酸检测的新突破

《Cell Research》：Target DNA-induced filament formation and nuclease activation of SPARDA complex

为探究 SPARDA 系统作用机制，湖北大学研究人员解析 NbaSPARDA 复合物，发现其丝状形成激活核酸酶，为相关研究提供依据。

　　在微观的细菌世界里，一场场 “防御战” 时刻都在上演。Argonaute（Ago）蛋白作为生物体内的 “卫士”，广泛存在于各个生命领域，其中原核生物的 Ago 蛋白（pAgos）在宿主防御中发挥着关键作用。短 pAgo 系统更是在原核生物基因组中广泛分布，像 SPARTA 和 SPARSA 系统，通过激活 NADase 结构域来抵御外来的质粒和病毒入侵。然而，与之相关的 SPARDA（Short Prokaryotic Argonaute and DNase/RNase - APAZ）系统却像是一个神秘的 “暗箱”，尽管它利用引导 RNA（gRNA）靶向入侵的互补 DNA，还展现出旁系核酸酶活性，能让细菌在面临威胁时选择 “死亡” 或 “休眠”，但人们对其详细的工作机制却知之甚少。

为了揭开 SPARDA 系统的神秘面纱，湖北大学的研究人员踏上了探索之旅。他们把目光聚焦在来自 Novosphingopyxis baekryungensis 的 NbaSPARDA 系统上，通过一系列深入研究，取得了令人瞩目的成果。相关研究成果发表在《Cell Research》杂志上，为我们理解细菌防御机制和核酸检测技术开辟了新的道路。

研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。在蛋白研究方面，通过分子克隆将 His 标记的 NbaAgo 和 strep 标记的 DREN - APAZ 分别克隆到 pRSFDuet - 1 载体中，再进行蛋白表达与纯化，获取研究所需的蛋白样本。利用冷冻电镜（cryo - EM）技术，对不同状态下的 NbaSPARDA 复合物进行结构解析，包括空载、结合 gRNA、结合不同长度 tDNA 以及结合底物单链 DNA（ssDNA）等状态，从而获取高精度的结构信息。同时，采用荧光淬灭（FQ）实验检测复合物的旁系核酸酶活性，借助噬菌斑实验和质粒干扰实验评估复合物对噬菌体和质粒的防御能力。

研究结果主要分为以下几个方面：

• NbaSPARDA 复合物的生化与结构特征：研究发现，NbaSPARDA 复合物的旁系核酸酶活性与靶 DNA（tDNA）长度密切相关。当 tDNA 长度为 19 - 21nt 时，能激活其全部活性；17 - 15nt 时活性较弱；13 - 11nt 时则无活性。通过冷冻电镜和尺寸排阻色谱（SEC）分析发现，较长的 tDNA（19 - 21nt）会使复合物聚集并形成丝状结构，而较短的 tDNA（13 - 11nt）则不会。这表明丝状形成与旁系核酸酶活性之间存在紧密联系，且二者的激活需要引导 - 靶异源双链足够长且在中心区域完全互补。同时，研究人员还解析了不同状态下 NbaSPARDA 复合物的结构，发现其在激活过程中会经历 “单体 - 二聚体 - 单体 - 丝状” 的转变。
• gRNA 诱导 NbaSPARDA 复合物二聚化：结合 gRNA 的 NbaSPARDA 复合物主要以二聚体形式存在。在二聚化过程中，APAZ - APAZ 和 Ago - Ago 界面的相互作用起着关键作用。比如，在 APAZ - APAZ 界面，F354.1 与 Y261.2、R260.2 形成 π 堆积相互作用；在 Ago - Ago 界面，NbaAgo.1 的 R301.1 插入到 NbaAgo.2 的柔性环形成的极性口袋中。此外，gRNA 与 NbaAgo 的 MID 结构域存在广泛相互作用，这些相互作用决定了 gRNA 的序列偏好和类型偏好。
• tDNA 诱导二聚体解聚和丝状形成：当 tDNA 加载到复合物中时，首先会破坏二聚体结构。研究发现，13nt 的 tDNA 会与二聚体结构产生空间位阻，导致二聚体解聚。而较长的 tDNA（如 21nt）在引导 - 靶异源双链延伸过程中会诱导丝状形成。丝状结构由 NbaAgo 蛋白构成骨干，APAZ 结构域和引导 - 靶异源双链位于外围，DREN 结构域在内层形成四聚体。在丝状形成过程中，MID - MID、PIWI - PIWI 和 MID - PIWI 界面的相互作用至关重要，关键氨基酸突变会影响复合物的旁系核酸酶活性和细菌对入侵 DNA 的防御能力。
• DREN 结构域核酸酶活性的激活：DREN 核酸酶结构域在复合物激活过程中，从柔性状态转变为在丝状复合物内层形成具有 D2 对称性的四聚体并稳定下来。四聚体的形成依赖于丝状结构的形成，且 DREN 结构域单独存在时无核酸酶活性。在底物结合复合物中，DREN 结构域采用 PD - (D/E) - XK 折叠，催化残基 D41、Q60 和 K62 参与底物 ssDNA 的切割。DREN 四聚体通过与底物 ssDNA 的相互作用，以及形成对称口袋容纳两个 ssDNA 分子形成假双链，从而激活旁系核酸酶活性。
• NbaSPARDA 复合物的工作模型：综合各项实验结果，研究人员提出了 NbaSPARDA 复合物的工作模型。当细菌受到噬菌体入侵时，NbaSPARDA 复合物经历 “单体 - 二聚体 - 单体 - 丝状” 的转变，DREN 结构域在丝状结构上形成四聚体并激活旁系核酸酶活性，持续降解宿主基因组和入侵 DNA，最终导致细菌死亡或休眠。

在讨论部分，研究人员指出，NbaSPARDA 复合物的靶标诱导丝状形成和 DREN 核酸酶结构域的丝状诱导四聚化，为其工作机制提供了全新的认识，这与 SPARTA 和 SPARSA 系统的机制不同，也不同于以往对 SPARDA 系统的认知。此外，研究还发现，装配形式的转变在各种细胞事件中起着关键作用，在不同的宿主防御系统中，寡聚化尤其是高阶装配都具有重要意义。虽然 NbaSPARDA 与其他短 Ago 系统存在差异，但也有相似之处，如 APAZ 结构域的作用、传感器环的功能等。同时，研究也提出了一些有待解决的问题，比如 DREN 核酸酶结构域四聚化激活旁系核酸酶活性的具体机制，以及 gRNA 加载导致 NbaSPARDA 复合物二聚化的原因等。

总的来说，这项研究深入解析了 NbaSPARDA 复合物的工作机制，揭示了其丝状形成与核酸酶激活的关键过程，不仅为理解细菌防御机制提供了重要线索，也为开发基于 SPARDA 系统的核酸检测技术奠定了理论基础，在生命科学和医学领域具有重要的研究价值和应用前景。