IS26 介导 blaKPC-2变异，揭示肺炎克雷伯菌耐药异质性之谜

《Mobile DNA》：IS26 carrying blaKPC?2 mediates carbapenem resistance heterogeneity in extensively drug-resistant Klebsiella pneumoniae isolated from clinical sites

为探究肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药异质性机制，研究人员分析携带 blaKPC-2的质粒，发现与 IS26 有关，对防控有重要意义。

　　在当今医疗领域，细菌耐药问题如同一场愈演愈烈的 “超级风暴”，严重威胁着人类健康。肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）作为常见的革兰氏阴性致病菌，频繁引发医院内感染，尤其是碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）的出现，更是让临床治疗陷入困境。随着时间推移，CRKP 的耐药率急剧上升，从 2005 年的 2.9% 一路飙升至 2023 年的 30%，这意味着越来越多的抗生素对它束手无策，医生们在面对这类感染时可选择的治疗方案越来越少。

在耐药机制中，携带碳青霉烯酶基因 bla_KPC的移动遗传元件起着关键作用，它就像一个 “耐药快递员”，在细菌间传递耐药性，使得耐药问题愈发复杂。而且，细菌耐药还存在一种奇特的现象 —— 耐药异质性，即同一细菌群体中不同个体对同一种抗生素的反应各不相同，这给临床感染治疗带来极大挑战，可能导致治疗失败，还会促使耐药菌株进一步进化。

为了揭开细菌耐药异质性的神秘面纱，探寻背后的机制，山东农业大学、济南钢城区人民医院等多家国内机构的研究人员联合开展了一项深入研究。该研究成果发表在《Mobile DNA》杂志上，为解决细菌耐药问题提供了新的思路和方向。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是细菌分离与鉴定技术，从患者血液样本中分离出肺炎克雷伯菌菌株，并通过自动化微生物质谱检测系统准确鉴定。其次是抗菌药物敏感性试验，利用 BD Phoenix M50 全自动微生物药敏分析仪、Kirby-Bauer（K-B）纸片扩散法以及 E-test 法，精确测定菌株对抗生素的敏感性。再者是全基因组测序技术，对分离出的菌株进行测序，深入分析其基因特征，包括耐药基因、毒力基因等。此外，还运用了 PCR 技术，验证特定基因序列的缺失情况。

研究结果如下：

1. 菌株分离与耐药性鉴定：从患者血液培养中成功分离出肺炎克雷伯菌，经 K-B 纸片扩散法检测发现其对亚胺培南（IPM）和美罗培南（MEM）存在耐药异质性。进一步纯化得到耐药亚群 KPTA-R1 和敏感亚群 KPTA-S1，E-test 法测定结果显示，KPTA-R1 对 IPM 和 MEM 的最低抑菌浓度（MIC）均为 32 μg/mL，而 KPTA-S1 的 MIC 分别为 0.5 μg/mL 和 1 μg/mL。同时，除了 IPM、MEM 和头孢他啶外，两个亚群的抗菌药物敏感性谱基本相同。通过分析生长曲线发现，KPTA-R1 和 KPTA-S1 的生长能力相似，且经过 10 代传代培养后，其对 IPM 和 MEM 的敏感性没有发生变化，表明碳青霉烯耐药异质性较为稳定。
2. 基因组特征分析：对 KPTA-R1 和 KPTA-S1 进行全基因组测序，结果显示，KPTA-R1 染色体长度为 5,501,168 bp，含有 4 个质粒；KPTA-S1 染色体长度为 5,501,115 bp，携带 5 个质粒。平均核苷酸同一性（ANI）分析表明，两者相似度高达 99.993%，多位点序列分型（MLST）鉴定均为 ST11 型，荚膜血清型为 KL64。在质粒携带的基因方面，KPTA-R1 的 pKPC-R 质粒携带 bla_KPC-2、bla_TEM-1和 rmtB 等耐药基因；而 KPTA-S1 的 pAR-S 质粒与 pKPC-R 高度相似，但缺少 bla_KPC-2基因编码序列。
3. IS26 介导的基因缺失机制：研究发现，pKPC-R 和 pAR-S 均属于 IncFII 质粒家族，且相似度极高。在 pKPC-R 中，bla_KPC-2基因位于由两个直接重复的 IS26 元件形成的复合转座子（PCTs）中，结构为 IS26-RecA-ISKpn27-bla_KPC-2-ISKpn6-IS26。而 pAR-S 在对应位置仅存在一个 IS26 元件，缺少 bla_KPC-2基因编码序列。通过 PCR 扩增和测序分析证实，在该 IncFII 质粒中，IS26 介导的转座活动可通过同源重组导致 bla_KPC-2基因缺失。
4. IS26 与 IncFII 质粒的进化关系：对 pKPC-R 和 pAR-S 及其他 8 个相似质粒进行系统发育分析，构建的系统发育树显示，这些质粒均属于 IncFII 型，且 pAR-S 和 pKPC-R 是该型质粒的不同进化变体。比较环形图谱发现，所有质粒都有一个共同的保守基因组区域，携带 bla_TEM-1和 rmtB 耐药基因，同时还存在多个移动遗传元件，其中 IS26 数量最多。这些结果表明，IS26 在 IncFII 质粒的进化过程中发挥着关键作用，与质粒的耐药功能密切相关。

研究结论和讨论部分指出，该研究首次报道了临床分离的肺炎克雷伯菌中存在碳青霉烯耐药异质性现象，且这种现象与 KPTA-R1 和 KPTA-S1 携带的 IncFII 质粒差异密切相关。在 IncFII 质粒中，IS26 的转座活动通过同源重组导致 bla_KPC-2基因缺失，进而引发耐药异质性。此外，质粒上多个 IS26 元件对质粒序列的多态性和耐药功能的进化具有重要影响。这一研究成果不仅加深了人们对细菌耐药机制的理解，为临床精准治疗提供了理论依据，还为开发新型抗菌策略指明了方向。例如，未来可以针对 IS26 介导的耐药机制，设计特异性的抑制剂，阻断耐药基因的转移，从而有效控制细菌耐药性的传播。同时，鉴于 IncFII 质粒携带多种耐药基因且在不同肠杆菌科细菌中广泛传播，对其进行持续监测至关重要，有助于及时发现和应对潜在的耐药危机。