甲醛（Formaldehyde，FA）作为一种在细胞信号传导中具有重要作用却难以捉摸的代谢物，是研究代谢物信号通路难题的典型代表。FA 是一碳代谢的关键中间产物，在人体中的稳态浓度约为 400 μM 。尽管其在细胞代谢中意义重大，但由于它具有高反应性和在细胞中短暂存在的特点，研究其信号通路困难重重。目前虽有荧光探针可检测细胞中的 FA，但尚无方法探究 FA 信号，这使得人们对其在细胞过程中的作用理解不完整。
为了填补这一研究空白，研究人员引入了基于活性捕获的多重成像（Trapping for Multiplex Imaging，Trami）策略，旨在开发一种能够将瞬态的 FA 信号转化为稳定荧光标记的化学探针，从而实现对 FA 信号通路的精确研究。
研究方法
Trami 探针的设计是实现这一研究目标的核心。研究人员利用 FA 触发的氮杂 - 科普（aza-Cope）反应来特异性地感知 FA，该反应在检测到 FA 后会生成醛 / 酮。接着，将其与丙烯醛调节的生物共轭反应相结合，使探针能够在感知 FA 的同时，将瞬态的 FA 信号转化为近端蛋白质上的永久荧光标记。在设计过程中，选用 β - 偕二甲基取代的 γ - 烯氨基促进 FA 的感知，引入烯基则使得在 FA 感知后能生成 α,β - 不饱和醛，进而与近端蛋白质结合存储 FA 信号。此外，利用分子内电荷转移（Intramolecular Charge Transfer，ICT）原理，通过合理定位 FA 触发基团和蛋白质标记基团，实现了对 FA 感知和蛋白质标记的智能荧光响应。
对 Trami 探针进行了全面的表征。在合成方面，通过一系列步骤成功制备了 Trami 探针，并利用质谱和核磁共振数据对其结构进行了精确确认。在性能方面，研究人员检测了探针在各种细胞培养基中的化学稳定性，结果表明其具有良好的稳定性。同时，对探针感知 FA 和共轭近端蛋白质的能力进行了深入研究，发现探针在与 FA 反应时，会呈现出剂量和时间依赖性的荧光关闭响应，且该响应具有高度的 FA 特异性。此外，还通过液相色谱 - 质谱（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）分析证实了探针在感知 FA 后能够转化为目标丙烯醛，并且丙烯醛能够与蛋白质发生共价结合，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF）分析确定了其与牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）的共轭比例约为 1:2。
为了研究 FA 与信号通路蛋白之间的关系，研究人员建立了外源性 FA 暴露模型，用 Trami 探针标记细胞以存储 FA 信息，然后进行免疫荧光染色，检测促炎 M1 小胶质细胞标记物 CD16 和抗炎 M2 小胶质细胞标记物 CD206 的表达。通过多色成像和量化分析，研究 FA 信号与这些标记物信号之间的相关性。同时，利用流式细胞术进一步验证探针的可靠性，检测细胞的吞噬活性和分泌的促炎细胞因子白细胞介素（Interleukin，IL） - 1β 水平，探究 FA 信号与这些指标之间的关系。此外，为了探究 FA 诱导炎症的机制，研究人员用抗氧化剂 Tiron 处理细胞，观察其对 FA 诱导的炎症反应的影响，并检测细胞的氧化应激水平和 DNA 损伤标记物 γH2AX 的水平。
在研究内源性 FA 介导的信号事件时，研究人员利用 Trami 探针检测炎症模型中内源性 FA 的水平。以 BV2 细胞为研究对象，用干扰素（Interferon，IFN） - γ/ 脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）或 IL - 4 处理细胞，诱导其向 M1 或 M2 表型极化，然后用 Trami 探针检测细胞内 FA 水平，并通过免疫染色和多色成像分析 FA 信号与炎症标记物之间的相关性。
为了探究调节细胞内 FA 代谢对炎症的影响，研究人员以酒精脱氢酶 5（Alcohol Dehydrogenase 5，ADH5）为研究靶点，它是负责 FA 代谢的主要酶。通过在 BV2 细胞中过表达或敲低 ADH5，然后用外源性 FA 或 LPS 刺激细胞，观察细胞内 FA 水平、炎症标记物表达以及 IL - 1β 分泌水平的变化。利用免疫染色和多色成像技术，分析 FA 信号与炎症信号之间的共定位关系，以确定 ADH5 在调节炎症反应中的作用。
研究人员还将 Trami 策略扩展到体内模型。建立小鼠局部神经炎症模型，通过向小鼠右侧侧脑室注射 LPS 诱导炎症，8 小时后注射 Trami 探针，然后对小鼠大脑进行切片，进行多重免疫染色，检测 FA 水平、炎症标记物（如 CD16、CD206）以及离子钙结合衔接分子 1（Ionized Calcium Binding Adaptor Molecule 1，Iba - 1）的表达，Iba - 1 是所有小胶质细胞的标记物，其表达随小胶质细胞激活而增加。通过多色成像和量化分析，研究体内 FA 水平与炎症反应之间的关系，以及激活的小胶质细胞与内源性 FA 生成之间的联系。
研究结果
成功设计并合成了 Trami 探针，该探针能够在活细胞中特异性地感知 FA，并将瞬态的 FA 信号转化为近端蛋白质上的稳定荧光标记。在与 FA 反应时，探针的荧光会发生剂量和时间依赖性的关闭响应，而与蛋白质结合后会产生新的荧光信号，且该荧光信号与原始探针的荧光信号有明显差异，便于在活细胞中记录 FA 感知和蛋白质标记过程。
在细胞实验中，Trami 探针展现出良好的性能。在 BV2 细胞和 HBVPs 细胞中，该探针能够有效跟踪 FA 的动态变化，并存储 FA 信号。当用外源性 FA 或能触发内源性 FA 爆发的刺激物处理细胞时，探针的荧光信号会发生相应变化，且在细胞固定后，能够保留 FA 触发的蛋白质标记信号，这为后续研究提供了可靠的信息。通过与免疫荧光染色相结合，发现 FA 信号与促炎标记物 CD16 呈正相关，与抗炎标记物 CD206 呈负相关，这表明 FA 在炎症反应中具有重要作用。此外，通过流式细胞术验证了 Trami 探针信号与细胞吞噬活性和 IL - 1β 分泌水平之间的正相关关系，进一步证实了其在研究 FA 信号通路中的可靠性。
在研究内源性 FA 介导的信号事件时，发现用 IFN - γ/LPS 诱导 BV2 细胞向 M1 表型极化时，细胞内源性 FA 水平显著上调，而用 IL - 4 诱导其向 M2 表型极化时，FA 水平无明显变化。这表明内源性 FA 参与了免疫细胞在极化过程中的促炎状态调节，进一步凸显了 FA 在炎症反应中的重要作用。
对 ADH5 的研究发现，过表达 ADH5 能够显著降低细胞内 FA 水平，抑制炎症反应，表现为 CD16 信号减弱和 IL - 1β 分泌减少；而敲低 ADH5 则会导致细胞内 FA 水平升高，炎症反应增强，CD16 和 CD206 信号上调。这表明 ADH5 通过调节细胞内 FA 水平，对炎症反应起到关键的调控作用，是一个潜在的抗炎靶点。
在体内模型研究中，发现小鼠在注射 LPS 诱导局部神经炎症后，注射部位的 FA 水平显著升高，且与炎症的进展相关，表现为 CD16、Iba - 1 和 IL - 1β 表达上调。通过多色成像和相关性分析，发现 Trami 探针信号与 CD16、Iba - 1 信号高度相关，且激活的小胶质细胞是内源性 FA 生成的主要来源。这一结果为理解体内炎症反应中 FA 的作用机制提供了重要依据。
研究结论
Trami 策略为研究 FA 提供了一种强大的工具，能够在活细胞中实现对 FA 的检测和瞬态信号的永久存储，具有无与伦比的空间分辨率，并能准确地将 FA 与信号通路相关联。通过该策略，研究揭示了内源性 FA 在促炎信号通路中的关键作用，确定了 ADH5 作为潜在的抗炎靶点，以及激活的小胶质细胞在急性脑炎症期间作为 FA 主要来源的重要发现。这些研究成果在技术和生物学领域取得了重大进展，为 FA 靶向治疗开辟了新的途径，也为未来研究其他代谢物信号通路提供了有价值的参考。
