细菌外膜生物发生的关键发现：YedD 对脂多糖（LPS）转运的重要作用

《Cell Reports》：Optimal functioning of the Lpt bridge depends on a ternary complex between the lipocalin YedD and the LptDE translocon

本文发现脂蛋白 YedD 是 Lpt 系统新成员，它能稳定 Lpt 桥，对革兰氏阴性菌外膜生物合成意义重大。

　　### 研究背景
革兰氏阴性菌的细胞包膜由内膜、外膜和其间的周质组成，外膜的独特性在于其外叶含有脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）。LPS 由疏水的脂质 A、核心寡糖区域和 O - 抗原组成，它使外膜成为有效的渗透屏障，能抵御包括抗生素在内的外界侵袭，还在维持细胞机械稳定性方面发挥重要作用。LPS 的转运依赖于脂多糖转运（Lipopolysaccharide transport，Lpt）通路，该通路由 7 种必需蛋白（LptABCDEFG）构成，从内膜延伸到外膜形成一座桥梁，其中 LptDE 转运体负责将 LPS 插入外膜外叶。尽管对 LPS 转运已有不少研究，但仍存在一些关键问题，如 LPS 如何从转运桥过渡到外膜并插入外叶，以及 Lpt 系统的调控机制等尚不清楚。因此，研究人员推测可能存在尚未发现的 Lpt 桥辅助成分参与系统功能，本研究旨在寻找这类成分并探究其作用。

研究方法

1. 蛋白质相互作用鉴定：通过将带有 C 末端 Strep 标签的 LptA（LptA_Strep）在细菌中低水平表达并进行亲和纯化，利用质谱（MS）分析共洗脱蛋白，以鉴定与 LptA 相互作用的分子。之后，共表达带有不同标签的 LptDE（LptE_Strep）和 YedD（YedD_6×His），并进行两轮亲和纯化，验证 YedD 与 LptDE 转运体的相互作用。
2. 结构分析：运用冷冻电镜（Cryo-EM）三维单颗粒重构技术，解析 LptDE - YedD 复合物的结构，获得其 3.89 ? 的电子电位图，为构建模型提供依据。
3. 位点特异性光交联实验：对质粒携带的 yedD 等位基因进行改造，在 YedD 的多个位点引入光交联性非天然氨基酸对苯甲酰基苯丙氨酸（pBpa），通过紫外线照射使 YedD 与 LptD 和 LptE 发生交联，再经免疫印迹检测交联产物，以此验证 YedD 与 LptDE 的相互作用界面。
4. 构建突变菌株及功能验证：构建一系列 LptD 突变体，如破坏 LptD 与 LptA 相互作用的 LptD_bridge，以及改变 LptD 中 β - taco 和 β - 桶状结构域之间铰链区域的 LptD_L1、LptD_L2等突变体。将这些突变体分别在野生型和 ΔyedD 背景下表达，通过效率平板测定（Efficiency of plating assays，EOPs）评估细菌生长情况，利用免疫印迹分析 LPS 的积累和 LptD 的氧化折叠状态，从而探究 YedD 在 Lpt 系统中的功能。

研究结果

1. YedD 与 LptDE 转运体结合：质谱分析发现，YedD 与 LptA_Strep共纯化，且 YedD 属于 lipocalin 家族的外膜脂蛋白。进一步实验证实，YedD 能与 LptDE 转运体形成稳定的 1:1:1 化学计量的三元复合物。
2. YedD 结合位点及界面：Cryo-EM 结构显示，YedD 结合在 LptD 的 N 端周质 β - taco 和 C 端 β - 桶状结构域之间的铰链区域。YedD 的结合未阻塞 LPS 分子到达外膜外叶的路径，且其与 LptD 的短 N 端 α 螺旋结合在 YedD 的疏水腔内。位点特异性光交联实验表明，YedD 与 LptD 和 LptE 均有相互作用，与 LptE 的相互作用可能涉及 LptE 的无序 C 末端区域。
3. YedD 对 LPS 转运的影响：虽然 YedD 不是必需蛋白，但在 Lpt 桥受损的情况下，ΔyedD 细胞会出现严重生长缺陷，LPS 在细胞膜内积累，且积累的 LPS 为迁移较慢的异常形式。在不同 LptD 突变体背景下，yedD 缺失对细胞生长的影响不同。当 LptD 的铰链区域或 LptD - LptA 相互作用发生突变时，yedD 缺失会导致细胞死亡；而当 LptB 功能受损但 Lpt 桥稳定性未受影响时，yedD 缺失对细胞适应性无明显影响。这表明 YedD 对维持 Lpt 桥的稳定性和优化 LptDE 活性至关重要，尤其在 Lpt 桥不稳定时，YedD 对细胞生存不可或缺。

研究讨论

本研究发现 YedD 是 Lpt 桥的组成部分，它与 LptDE 转运体相互作用，稳定 Lpt 桥并优化 LPS 转运。YedD 与其他已知与 LptD 相互作用的蛋白（如 BepA 和 YifL）不同，它直接参与 Lpt 系统的功能。虽然未检测到 YedD 与 LPS 的直接结合，但它可能通过稳定 Lpt 桥和调节 LptDE 转运体的构象来促进 LPS 转运。YedD 在 Enterobacterales 目中高度保守，存在于许多人类病原体中，这表明它可能在病原体维持外膜屏障完整性和致病过程中发挥重要作用。此外，由于 LptDE 转运体是抗生素发现的关键靶点，YedD 与 LptD 的相互作用为开发新型抗菌药物提供了新的思路和潜在靶点。然而，本研究也存在一定局限性，YedD 的精确分子功能尚不清楚，且实验是在实验室条件下进行的，与实际生理环境可能存在差异，后续还需进一步研究来明确 YedD 在 Lpt 系统活动和外膜生物发生中的具体作用。