呼吸道病毒感染防御新机制：CIC-ATXN1L 复合物的双重调控作用

《Cell Host & Microbe》：Transcriptional repressor Capicua is a gatekeeper of cell-intrinsic interferon responses

本文揭示 CIC-ATXN1L 复合物在稳态和病毒感染时对 IFN 和 ISGs 的调控机制，为抗病毒研究提供新思路。

　　### 研究背景
细胞内固有免疫反应在识别病毒核酸后，通过一系列信号传导，激活 I 型干扰素（IFN）和干扰素刺激基因（ISGs）的转录，限制病毒复制。然而，在无菌条件下，异常激活相关通路会导致炎症性疾病。目前已知一些负调控因子可抑制相关信号级联反应，但对于 IFN 和 ISGs 启动子转录的负调控机制尚未完全明确。本文聚焦于 Capicua（CIC）和 Ataxin-1 like（ATXN1L）组成的 DNA 结合转录抑制复合物，探究其在调控 IFN 和 ISGs 转录中的作用。

CIC 或 ATXN1L 缺陷细胞中 IFN 和 ISGs 表达升高

此前研究通过全基因组 CRISPR-Cas9 敲除筛选，发现 CIC 对调节抗病毒反应至关重要。研究人员对对照或 CIC 敲除（KO）的 A549 细胞（人肺上皮细胞系）进行流感 A 病毒（IAV）病毒 RNA（vRNA）转染或 IFN 处理，结果显示，CIC KO 细胞在模拟条件以及 IAV vRNA 转染或重组 IFN-I 刺激后，IFNB1 和 ISG 的表达水平均高于对照细胞。同时，已知的 CIC 靶基因 ETV4 在 CIC KO 细胞中也高度上调，且 CIC 转录本水平在 vRNA 和 IFN 刺激后随时间增加。这表明 CIC 可能调节通过 RLR 和 JAK-STAT 信号诱导的炎症基因。

由于 CIC 需与 ATXN1 或其同源物 ATXN1L 形成稳定的转录抑制复合物，研究人员构建了 ATXN1L CRISPR KO A549 细胞。结果发现，ATXN1L KO 细胞与 CIC KO 细胞类似，IAV 复制受限，IFNB1 和 ISG 转录本水平升高。在原代人呼吸道基底细胞中进行 CIC 和 / 或 ATXN1L 的小干扰 RNA（siRNA）敲低实验，也验证了上述在 A549 KO 细胞中的发现。这些结果表明，CIC-ATXN1L 抑制复合物是 IFN 和 ISG 表达的关键调节因子。

CIC KO 细胞中 IFN 和 ISGs 的全局上调

为了解 CIC 缺失是导致个别 ISG 上调还是引起 ISG 整体变化，研究人员对对照和 CIC KO A549 细胞进行 RNA 测序（RNA-seq）分析。结果显示，在模拟或 IAV 感染条件下，分别鉴定出 800 和 3,608 个差异表达基因（DEGs），且超过 60% 的 DEGs 在 CIC KO 细胞中表达升高。CIC KO 细胞中先天免疫反应基因全局上调，包括多种先天免疫限制因子、抗病毒转录因子（TFs）、核酸传感器、细胞因子和趋化因子等。

通过基因本体（GO）评估和基因集富集分析，发现 DEGs 在宿主抗病毒反应途径中显著富集，且在 CIC KO 细胞中，包含 IRF 和 ISRE TF 基序的调控序列也显著富集。这说明 CIC 是众多先天炎症反应基因的综合调节因子，而非仅调节个别 ISGs。

内源性 dsRNAs 在无菌条件下触发 CIC KO 细胞中 ISG 表达

研究人员推测 CIC KO 细胞在基础条件下众多 ISG 的大规模上调是由于 IRFs 和 ISGF3 的激活。通过免疫荧光检测，发现 CIC KO 细胞中 IRF2 和 IRF9 的表达和核定位增加。

已知宿主来源的 dsRNAs 可激活 MDA-5（RLR 通路），为探究 CIC KO 细胞中 IRF 激活是否由内源性 dsRNA 配体触发，研究人员构建了同时缺失 CIC 和 RLR 接头蛋白 MAVS（C/MAVS DKO）以及缺失 CIC 和 STAT1（C/STAT1 DKO）的细胞。结果显示，C/MAVS DKO 细胞中 IFNB1 水平降至与对照 A549 细胞相似，表明 CIC KO 细胞中 IFNB1 表达升高是由 RLR-MAVS 通路的激活导致，可能是内源性 dsRNA 配体的作用。此外，C/STAT1 DKO 细胞中基础 IFNB1 水平仍高于对照细胞，且外源 I 型 IFN 处理后，C/MAVS DKO 细胞中 MX1 表达显著高于对照细胞，这表明 CIC 也调节由 IFNR 信号诱导的 ISGs。这些结果表明，CIC KO 细胞中 IFN 和 ISGs 的全局上调是由真正的抗病毒 TFs 激活驱动的，CIC 对阻断内源性 dsRNAs 通过 RLR 途径引发的炎症反应至关重要。

CIC 调节 IFN 反应关键基因的染色质可及性

CIC 作为 DNA 转录抑制因子，研究人员通过转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）分析，研究 CIC KO 与对照 A549 细胞在模拟和 IAV 感染条件下的染色质可及性景观。结果显示，在模拟条件下，CIC KO 细胞与对照细胞之间检测到 6,992 个差异染色质可及性峰，注释到 4,400 个基因，其中 3,904 个峰在 CIC KO 细胞中与固有免疫反应途径关键基因的基因座处可及性显著增加。在 IAV 感染条件下，鉴定出 11,004 个差异可及性峰，注释到 5,698 个基因。虽然 RNA-seq 中鉴定的 DEGs 只有部分在 ATAC-seq 分析中显示出相应的染色质可及性变化，但在显示差异染色质可及性的 DEGs 中，绝大多数在 CIC KO 细胞中上调。这表明 CIC 对调节大量 ISGs 的染色质可及性和表达至关重要。

潜在 CBS 基序在 ISG 启动子附近的鉴定

果蝇 Cic 通过结合 CBS 基序介导转录抑制，研究人员评估具有差异染色质可及性的基因是否富含 CBS 基序。利用果蝇 Cic 的规范 CBS 基序（TSAATGRR），发现超过 93% 的相关基因在模拟和 IAV 感染条件下都含有 CBS 基序，包括 MX1、ISG15 等。通过整合 RNA-seq、ATAC-seq 和 CBS 基序分析的数据，鉴定出在模拟和 IAV 感染条件下分别有 324 个和 1,108 个符合所有三个标准的共同基因，其中许多是细胞内抗病毒反应途径的组成部分。HOMER 分析显示，在模拟条件下，IRF 和 ISRE 基序与 CBS 基序显著共富集，表明 CIC 缺失可能以 IRF 依赖的方式放大 ISG 诱导。这些结果表明，CIC 可能通过结合鉴定出的 CBS 基序，在 IFN 和 ISG 启动子处发挥转录抑制作用。

CIC 抑制含有 CBS 基序的 ISG 启动子的转录

为验证 CIC 对含有 CBS 基序的抗病毒反应基因启动子的转录抑制功能，研究人员设计并测试了带有六个 CBS 基序拷贝的合成 IFNB1 启动子报告基因（IFNβ-6XCBS）。共表达 CIC 和 ATXN1 可抑制由组成型激活的 RIG-I-2CARD（RIG-I (2C)）或仙台病毒（SeV）刺激的 IFNβ-6XCBS 启动子的荧光素酶表达，且这种抑制具有序列特异性，因为 CIC-ATXN1 无法抑制含有突变 CBS 基序（IFNβ-6XCBS^Mut）的报告基因的表达。

研究人员还评估了 CIC-ATXN1 对含有 1 - 3 个天然 CBS 基序的内源性 ISG 启动子（如 MX1、IFIT1 和 TRIM22）的抑制能力，结果显示其可抑制这些启动子的荧光素酶表达，而突变 CBS 基序则可消除这种抑制作用。此外，构建的合成 CIC-VP64 可诱导含有 CBS 基序的 ISG 启动子的荧光素酶表达，且这种诱导依赖于 CBS 基序。这些结果表明，CIC 通过与 CBS 基序直接相互作用，抑制 ISG 启动子的转录。

CIC-ATXN1L 抑制复合物在 IAV 感染期间迅速降解

在病毒感染期间，及时解除 CIC 对 IFN 和 ISG 启动子的抑制对于强大的抗病毒反应至关重要。研究人员评估了 IAV 感染期间 A549 细胞中 CIC 的水平，发现 IAV 感染细胞中 GFP-CIC 完全缺失，同时利用特异性抗体验证了内源性 CIC 和 ATXN1L 的缺失。通过建立 IAV 感染期间的降解时间线，发现 CIC 和 ATXN1L 水平在感染后 40 分钟开始下降，且这种降解是蛋白酶体依赖的，因为蛋白酶体抑制剂可阻断其降解。在原发性人呼吸道基底细胞中也观察到类似现象。此外，在感染后期，CIC 和 ATXN1L 蛋白水平逐渐增加，外源性 IFN 处理也可诱导其短暂降解。这些结果表明，CIC 对 IFN 和 ISG 启动子的抑制在 IAV 感染期间通过复合物的蛋白酶体依赖降解迅速解除。

CIC-ATXN1L 复合物在呼吸道病毒感染期间通过 EGFR-MAPK 通路降解

研究人员发现，不同 IAV 亚型以及其他呼吸道病毒（如呼吸道合胞病毒（RSV）、人副流感病毒 3 型（HPIV）和 SeV）感染 A549 细胞后，CIC 和 ATXN1L 蛋白水平均下降，而非呼吸道病毒（如寨卡病毒、脑心肌炎病毒（EMCV）和埃博拉糖蛋白假型水泡性口炎病毒（EGP-VSV））感染时，其水平不变。

呼吸道病毒感染会激活 RTK-MAPK 通路，研究人员通过在 A549 细胞中使用 MEK 抑制剂（MEKi）或 ERK 抑制剂（ERKi）处理，发现可完全阻断 IAV 感染诱导的 CIC-ATXN1L 复合物降解。此外，重组病毒血凝素（HA）蛋白与宿主细胞受体结合可触发 CIC-ATXN1L 降解。这些结果表明，呼吸道病毒进入宿主细胞时激活的 EGFR-MAPK 信号通路可触发 CIC-ATXN1L 复合物的降解。

去除 CIC 抑制对强大的抗病毒反应至关重要

抑制 CIC-ATXN1L 降解会影响 ISG 诱导的程度，研究人员用 MEKi 或 ERKi 预处理 A549 细胞，发现可显著降低 IFNB1 和 MX1 转录本水平，而在 CIC KO 细胞中，这种预处理对 ISG 诱导无显著影响。外源性 EGF 处理可诱导 CIC-ATXN1L 复合物快速降解，并增强对 EMCV 和 EGP-VSV 感染的 IFN 和 ISGs 表达。这些结果表明，通过激活 EGFR-MAPK 通路及时去除 CIC 对 IFN 和 ISG 启动子的抑制，对强大的抗病毒反应启动至关重要。

小鼠 Cic 对 IFN 和 ISG 启动子抑制功能的保守性

CIC 是进化上保守的基因，研究人员利用 tamoxifen 诱导的 Cic KO 小鼠模型，构建了缺乏 CIC 的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）和骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）。结果显示，IAV 感染 MEFs 后，CIC-ATXN1 复合物降解，且在这三种细胞类型中，缺失小鼠 Cic 会导致 Ifnb1 和 ISG 转录本在模拟和 IAV 感染条件下诱导更高。

对 Cic KO 和对照小鼠肺部进行 RNA-seq 分析，发现 Cic KO 小鼠肺部在模拟条件下，IFN、ISGs 和细胞因子 / 趋化因子表达升高，GO 评估显示相关基因在宿主抗病毒反应中显著富集。在 IAV 感染的体内模型中，Cic KO 小鼠体重减轻减少，恢复更快，肺部病毒载量更低，Ifnb1 和 ISGs 表达更高，炎症面积更小。此外，用 MEK 抑制剂处理小鼠，可显著降低 Poly IC 诱导的 ISGs 表达，且这种影响在 Cic KO 小鼠中不明显。这些结果表明，小鼠 CIC 在体内调节针对呼吸道病毒感染的炎症反应中至关重要，且 MAPK 途径诱导的 CIC 降解对强大的抗病毒反应转录上调至关重要，揭示了 CIC 介导的抗病毒反应途径转录抑制在人类和小鼠之间的保守性。

研究讨论

本文揭示了 CIC 在正常条件下可防止宿主来源的内源性 dsRNA 配体异常激活 IFN 和 ISGs 的转录，而在呼吸道病毒感染时，CIC-ATXN1L 抑制复合物通过 EGFR-MAPK 级联降解，使宿主细胞能够迅速启动抗病毒反应。小鼠 CIC 在稳态下同样抑制 IFN 和 ISG 表达，这突出了 CIC 介导的宿主 IFN 反应转录调控的进化保守性。

CIC 在从果蝇到人类的进化过程中具有保守性，其在果蝇中通过结合 CBS 基序介导转录抑制，在人类中也通过类似机制调节 IFN 和 ISG 启动子。此前认为 IFN 和 ISG 启动子在稳态下默认关闭，除 FOXO3 外，稳态负调控主要通过对相关通路组件的翻译后修饰。而本研究发现 CIC-ATXN1/L 转录抑制复合物通过结合 CBS 基序对 IFN 和 ISG 启动子进行负调控，为炎症反应基因的调控提供了新的范式。

病毒利用宿主的 MAPK 信号通路促进自身生命周期，呼吸道病毒感染早期可触发 CIC-ATXN1L 降解，使宿主能够快速启动抗病毒反应。然而，持续激活 EGFR 和 MAPK 通路可能导致炎症反应过度，如 “细胞因子风暴”。MEK 和 ERK 抑制剂可用于治疗癌症，但 CIC 功能丧失突变会使癌细胞对这些抑制剂产生抗性。此外，CIC 缺失与一些癌症和自身免疫疾病相关，推测其可能与慢性低度炎症促进疾病进展有关。

综上所述，本研究建立了 CIC-ATXN1L DNA 结合抑制复合物对 IFN 和 ISGs 调控的新范式，其意义不仅限于病毒免疫，还涉及癌症、自身免疫疾病和发育障碍等与免疫稳态失调相关的疾病。