RIPK1 信号通路在肌萎缩侧索硬化中的关键作用及潜在治疗意义

《Immunity》：Single-cell transcriptomic and functional studies identify glial state changes and a role for inflammatory RIPK1 signaling in ALS pathogenesis

本文揭示肌萎缩侧索硬化（ALS）中胶质细胞状态变化及 RIPK1 作用，为疾病治疗提供新思路。

　　

研究背景

肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种致命的神经退行性疾病，以运动神经元进行性丧失和肌肉无力为特征。约 90% 的 ALS 病例为散发性，病因不明，10% 与基因突变有关。目前获批药物疗效有限，患者平均生存期仅 3 - 5 年，存在大量未满足的医疗需求。

神经炎症在 ALS 中的有害作用日益受到关注。小胶质细胞激活、反应性星形胶质细胞增生和免疫功能障碍在 ALS 小鼠模型和患者中均有发现。研究表明，小胶质细胞和星形胶质细胞对 ALS 疾病进展有非细胞自主贡献，如敲除相关基因可延缓疾病进展、延长生存期，人类 ALS 患者来源的星形胶质细胞在体外可诱导运动神经元死亡。此外，ALS 患者运动皮层和脊髓的大量 RNA 测序（RNA-seq）数据显示，小胶质细胞和星形胶质细胞标记基因及炎症相关基因表达增加，但特定胶质细胞亚群或状态在疾病中的出现情况以及如何靶向这些细胞和相关神经炎症尚不清楚。

研究方法

1. 组织样本：研究使用了来自 6 例散发性和 2 例家族性 ALS 患者以及 4 例年龄和性别匹配的对照的尸检颈椎脊髓样本，还包括来自 NIH 神经生物样本库、Target ALS 的样本以及 PrecisionMed 提供的脑脊液（CSF）样本。动物实验采用 B6.Cg-Tg (SOD1^?G93A) 1Gur/J 小鼠和非转基因 C57BL6/J 对照小鼠。
2. 测序分析：对脊髓样本进行批量 RNA-seq 和单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq），分析基因表达变化和细胞状态。对 iPSC 衍生的运动神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞三培养物进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），以确定 RIPK1 激活后的转录变化。
3. 药物处理与实验：用 RIPK1 激酶抑制剂 GSK′547（RIPK1i）处理 SOD1^G93A小鼠，观察症状发作、运动功能和神经炎症反应。对三培养物上清液进行 Olink 蛋白质组分析，检测 RIPK1 调节的细胞因子。分析 ALS 患者 CSF 样本中的细胞因子水平，并评估 RIPK1 抑制剂 SAR443060 对患者 CSF 中细胞因子的影响。
4. 其他实验方法：采用免疫组织化学（IHC）评估蛋白质变化，利用 Meso Scale Discovery（MSD）平台检测 RIPK1 蛋白及其磷酸化水平，进行功能运动测试评估小鼠运动能力。

研究结果

1. ALS 脊髓中胶质细胞状态变化和神经炎症显著：批量 RNA-seq 分析显示，ALS 脊髓中基因表达广泛改变，炎症和免疫相关生物过程上调，突触信号和神经元相关功能相关过程下调。snRNA-seq 分析捕获了主要细胞类型，细胞聚类表明 ALS 中微胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPCs）和少突胶质细胞（OLs）发生了与疾病相关的变化。细胞类型特异性伪批量分析显示，星形胶质细胞和微胶质细胞的差异表达基因（DEGs）数量最多，表明神经炎症信号失调可能参与疾病发病机制。
2. ALS 富集的微胶质细胞和星形胶质细胞呈现不同的转录细胞状态：对微胶质细胞和星形胶质细胞进行亚聚类分析，发现微胶质细胞分为四个不同群体，其中 Mg 2 和 Mg 3 亚群在 ALS 脊髓中增加，且表达与免疫、神经退行性疾病相关的基因。星形胶质细胞分为三个群体，Ast 2 和 Ast 3 亚群在 ALS 脊髓中相对富集，分别表达与炎症调节、细胞死亡和炎症反应相关的基因。免疫组化验证了这些蛋白在 ALS 中的存在，伪时间分析显示疾病相关亚群的基因表达随时间变化。
3. ALS 脊髓中 DA-OPCs 和 OLs 增加：对 OPCs 和 OLs 进行亚聚类分析，发现 ALS 脊髓中经典 OPCs 减少，增殖性 OPCs、成熟 OL 前体 / 新形成 OLs（COP/NFOL）和疾病相关 OPCs（DA-OPCs）增加。OLs 分为四个群体，ALS 脊髓中成熟 OLs 减少，MFOL 和 DA-OLs 状态增加。GO 分析显示 OLs 的 DEGs 中脂质代谢下调，免疫和炎症相关信号上调。
4. RIPK1 表达和坏死性凋亡特征在 ALS 脊髓中富集：通过对批量 RNA-seq DEGs 的分析，发现调节程序性细胞死亡、焦亡和坏死性凋亡等信号节点在 ALS 脊髓中显著富集。RIPK1 是坏死性凋亡信号通路的核心成分，在 ALS 脊髓中表达上调，其激酶活性也升高。在多个 ALS 队列中，RIPK1 蛋白在脊髓中尤其是不溶性蛋白部分升高，且 RIPK1 激活与微胶质细胞和星形胶质细胞中炎症相关基因表达相关。
5. RIPK1 激酶抑制延缓疾病进展并调节 SOD1^G93A小鼠的神经炎症：用 RIPK1i 处理 SOD1^G93A小鼠，延迟了症状发作和体重减轻，延缓了运动功能障碍，但对生存影响不显著。scRNA-seq 分析显示，RIPK1i 部分逆转了胶质细胞的变化，调节了数十个基因的表达，这些基因与炎症和免疫反应调节相关。
6. 在人类运动神经元 - 胶质三培养物和患者 CSF 样本中鉴定 RIPK1 依赖性胶质生物标志物：利用 iPSC 衍生的三培养系统，发现肿瘤坏死因子（TNF）、Smac 模拟物和泛半胱天冬酶抑制剂 zVAD-fmk（TSZ）刺激导致星形胶质细胞和微胶质细胞的细胞状态发生显著变化，且 RIPK1 调节的细胞因子在三培养物中增加。这些细胞因子在 ALS 患者的 CSF 中也显著升高，且在接受 RIPK1 抑制剂 SAR443060 治疗的患者 CSF 中，部分细胞因子浓度降低，表明这些细胞因子可能是监测炎症信号和治疗效果的潜在生物标志物。

研究讨论

1. 研究成果与意义：该研究通过对 ALS 脊髓的转录组分析，揭示了疾病相关的胶质细胞状态变化，确定了 RIPK1 作为炎症和细胞死亡的关键调节节点。在 SOD1^G93A小鼠中的实验表明，抑制 RIPK1 激酶活性可延缓疾病进展，调节胶质细胞基因表达。在人类三培养物和 CSF 样本中鉴定出 RIPK1 调节的细胞因子，为监测疾病进展和治疗效果提供了潜在的生物标志物，为 ALS 的治疗提供了新的靶点和思路。
2. 研究局限性：研究主要集中在 SOD1^G93A小鼠模型，未来需探索其他模型中 RIPK1 信号通路的作用。人类组织分析样本数量有限，需在更大队列中进行验证。虽然观察到胶质亚型标记蛋白的表达，但需要进一步研究其细胞类型和区域分布。此外，对神经炎症发作的时间以及 RIPK1 信号在脊髓外的变化了解不足，且未明确 RIPK1 蛋白与疾病持续时间和发病位置的关系。

研究展望

未来研究可进一步探索不同 ALS 小鼠模型中 RIPK1 信号通路的作用，扩大人类组织样本数量和类型，利用空间转录组学等技术更精确地研究胶质细胞状态和 RIPK1 信号的分布。深入研究神经炎症的起始和发展过程，以及 RIPK1 信号与其他炎症和细胞死亡通路的相互作用，有助于开发更有效的治疗策略。同时，验证和拓展已发现的生物标志物，将有助于更准确地监测疾病进展和评估治疗效果，推动 ALS 治疗的发展。