UbiREAD 技术解锁泛素链降解密码，揭示细胞内蛋白调控奥秘

本文利用 UbiREAD 技术，系统研究泛素（Ub）链介导的细胞内降解，为理解蛋白调控机制提供关键依据。

　　### 研究背景
泛素（Ub）作为一种重要的翻译后修饰，几乎所有细胞内蛋白质在其生命周期中都经历泛素化。Ub 自身也能被泛素化，形成多种不同类型的链，包括同型链和分支链，这些链构成了 “泛素密码”，决定了修饰底物的命运。其中，泛素化最广为人知的功能是引发 26S 蛋白酶体降解，但解读泛素降解密码面临诸多挑战。细胞内大部分泛素链由 K48 或 K63 连接组成，虽然生化实验表明这两种链都可作为蛋白酶体的降解信号，但细胞内降解主要依赖 K48 连接的泛素链，K63 链则更多与非降解功能相关。此外，分支泛素链的作用尚不明确，其在细胞内的异质性使得难以系统比较不同泛素链的降解能力。因此，开发一种能够在细胞内系统研究泛素链功能的技术至关重要。

设计

为了系统研究 K48、K63 和 K48/K63 分支泛素链对模型底物细胞内降解的影响，研究人员构建了 UbiREAD 技术。该技术主要包括三个关键部分：首先，通过制备特定长度和组成的泛素链，并将其与单泛素化的绿色荧光蛋白（GFP）模型降解底物结合，合成泛素化蛋白。为固定链长，在远端泛素的相应赖氨酸突变为精氨酸，如 K48R 用于 K48 链。其次，选用经工程改造可高效被蛋白酶体降解的 GFP 变体作为底物报告分子，便于检测。最后，利用电穿孔技术将功能重组蛋白高效导入细胞质，该方法相较于其他蛋白递送方法，能在毫秒内完成，适合进行动力学分析。

结果

1. UbiREAD 技术验证：研究人员成功合成了多种类型的泛素_n-GFP，并通过泛素链限制（UbiCRest）验证了其纯度和结构。将 GFP 和 K48-Ub₄-GFP 通过电穿孔导入 RPE-1 细胞后发现，K48-Ub₄-GFP 的荧光在细胞内迅速减弱，而 GFP 本身荧光稳定，表明 K48-Ub₄-GFP 发生了降解。通过抑制剂实验进一步证实，K48-Ub₄-GFP 的降解依赖蛋白酶体活性和预先组装的泛素链，而非细胞内的泛素化过程，从而建立了 UbiREAD 方法。
2. 细胞内 K48 依赖的降解迅速：利用 UbiREAD 技术研究 K48-Ub₄-GFP 的细胞内降解动力学，发现其降解在 6 分钟内达到平台期，半衰期约为 1 分钟，比未修饰的 GFP 快两个数量级。且增加 K48-Ub₄-GFP 的电穿孔量不会改变降解半衰期和降解底物的量。在多种哺乳动物细胞系中进行测试，结果显示 K48-Ub₄-GFP 的降解半衰期在 1 - 2.2 分钟之间，表明该技术可用于监测不同细胞系中的细胞内降解动力学。这种快速降解速率与细胞内蛋白质合成的速率相当，提示蛋白酶体降解系统在调节蛋白质稳态中起着关键作用。
3. K48-Ub₃是细胞内蛋白酶体降解的最小信号：合成不同长度的 K48-Ub_n-GFP（n = 2 - 6）并监测其在 RPE-1 细胞中的稳定性，发现当泛素链长度达到 3 时，降解迅速且高效，进一步增加链长并未显著加速降解。同时，K48-Ub₂-GFP 的去泛素化水平较高，半衰期约为 2 分钟。这表明 K48-Ub₃是细胞内蛋白酶体降解的最小信号，与体外生化重构实验结果不同，细胞内存在其他因素参与降解过程。
4. K63 泛素链迅速去泛素化：合成 K63-Ub_4/6/8-GFP 并导入 RPE-1 细胞，发现其荧光未显著降低，表明 K63 链未诱导有效降解。通过凝胶内荧光检测发现，K63 链在细胞内迅速去泛素化，半衰期在 1 分钟左右，比之前估计的速度更快。这说明在细胞内，K63 链的去泛素化速度快于其促进进入蛋白酶体降解途径的速度，或者 K63 链缺乏作为蛋白酶体底物的信息。
5. K48/K63 分支链的降解层次：研究人员开发了一种合成策略，制备了携带 K48/K63 分支泛素链的 GFP。将这些修饰后的 GFP 导入 RPE-1 细胞后发现，当主链为 K63 时，降解程度较低，主要发生去泛素化；而当主链为 K48 且携带 K63 分支链时，虽然能发生降解，但效率比同型 K48 链稍低。这表明在 K48/K63 分支链中，与底物锚定的泛素链具有优先性，决定了底物的降解或去泛素化行为，为泛素密码增加了新的复杂性。

讨论

UbiREAD 技术能够在细胞质环境中，以高时间分辨率系统比较不同泛素链编码的降解和去泛素化过程。研究发现，K48 泛素化诱导的降解速度与核糖体翻译速度相当，K48 链长度调节降解和去泛素化之间的动力学竞争，而 K63 链无论长度如何都不会诱导有效降解，反而迅速去泛素化。此外，K48/K63 分支泛素链的行为取决于其组装顺序，表现出协同依赖性。这些结果揭示了泛素链的降解密码，为理解细胞内最基本的过程之一提供了重要线索。

该研究还建立了一个可适应的平台，用于分析与预形成的泛素和泛素样蛋白（Ubl）链结合的模型底物的细胞内降解。UbiREAD 技术不仅适用于研究 K48 和 K63 以外的泛素链的细胞内降解和去泛素化能力，还可用于探索泛素链与其他翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化）的组合效应。虽然 K48 和 K63 是主要的细胞泛素信号，但其他类型的泛素链，如 K11/K48 和 K29/K48 链，在细胞过程中也发挥着重要作用，未来研究可进一步探讨这些链的功能以及它们是否也存在功能层次。

研究局限性

尽管电穿孔技术能够实现细胞质递送，但该方法未涉及亚细胞区室化的影响，无法分析核内的泛素信号。此外，研究中使用的泛素链是在细胞外合成的，这可能忽略了 E3 连接酶在细胞内形成泛素链过程中招募其他调节降解因子的信息。研究仅使用了一种底物蛋白（GFP），而许多细胞蛋白与 GFP 不同，未来需要探索其他具有不同特性的泛素化底物。同时，为获得足够纯度和产量的定义明确的泛素化蛋白，研究中进行了蛋白质工程改造，包括在 GFP N 端连接泛素和在远端泛素进行 K-to-R 突变，未来可采用化学蛋白质合成或化学生物学方法克服这些限制，并进一步研究泛素化位点对细胞内蛋白质降解的影响。

资源可用性

研究中产生的所有独特 / 稳定的试剂均在关键资源表中列出，可通过与主要联系人（Leo Kiss，[e-mail]）签订材料转移协议获取。原始图像和质谱蛋白质组学数据已分别存储在 Mendeley 数据和 ProteomeXchange Consortium via PRIDE 合作伙伴存储库中，数据集标识符可在关键资源表中查询。论文未报告原始代码，如需重新分析数据，可向主要联系人索取相关信息。