E3 泛素连接酶 FBXO32 调控 ANXA1/PI3K/AKT 信号通路促进 LPS 诱导的心脏损伤研究

《Inflammation》：E3 Ubiquitin Ligase FBXO32 Promotes LPS-Induced Cardiac Injury by Regulating ANXA1/PI3K/AKT Signaling

为解决脓毒症诱导的心肌病（SIC）治疗难题，研究人员探究 FBXO32 在 SIC 发病机制中的作用，发现其促进 LPS 诱导的心脏损伤，为 SIC 治疗提供新靶点。

　　在脓毒症的战场上，脓毒症诱导的心肌病（SIC）就像一位隐藏的 “杀手”，悄然威胁着患者的生命。SIC 作为脓毒症最严重的并发症之一，极大地增加了患者的死亡率。目前，SIC 的治疗手段虽然多样，包括感染控制、液体管理、使用血管活性药物和正性肌力药物进行药物治疗，以及循环支持等非药物干预措施，但这些方法不仅成本高昂，还消耗大量医疗资源，患者的安全和生活质量受到严重影响。因此，寻找新的治疗靶点成为了攻克 SIC 的关键。

在这样的背景下，兰州大学第一临床医学院等机构的研究人员开展了一项意义重大的研究。他们聚焦于 E3 泛素连接酶 F-box-only protein 32（FBXO32），深入探究其在 SIC 发病机制中的作用，相关研究成果发表在《Inflammation》杂志上。

研究人员采用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，培养 H9c2 细胞并进行分组处理，运用 RNA 测序（RNA-seq）筛选差异表达基因，通过细胞转染改变基因表达水平，利用细胞活力检测（如 CCK-8 法）、细胞凋亡检测（Annexin V-FITC/PI 双染法）、活性氧（ROS）检测、线粒体膜电位检测等技术，评估细胞状态和功能变化。在动物实验中，选用 SPF 级雄性 SD 大鼠，构建 LPS 诱导的心脏损伤模型，通过心肌注射腺相关病毒（AAV9）敲低 Fbxo32 表达，运用苏木精 - 伊红（HE）染色观察心肌组织形态，末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记（TUNEL）染色检测心肌细胞凋亡，透射电子显微镜（TEM）观察心肌组织超微结构，以及检测血液中相关生物标志物水平等。

研究结果如下：

• Fbxo32 在 LPS 诱导的心脏损伤大鼠心肌细胞中上调：RNA-seq、qRT-PCR 和 western blotting 检测结果显示，在 LPS 诱导的心脏损伤大鼠和 H9c2 细胞模型中，FBXO32 的表达均显著升高。
• 敲低 Fbxo32 减轻 LPS 诱导的 H9c2 细胞线粒体功能障碍和凋亡：通过慢病毒介导的短发夹 RNA（shRNA）敲低 Fbxo32，CCK-8 实验表明细胞活力显著提高，Annexin V-FITC/PI 流式细胞术检测发现细胞凋亡率显著降低，同时，ROS 荧光强度降低，线粒体膜电位升高，说明敲低 Fbxo32 减轻了细胞内 ROS 产生，改善了线粒体膜电位。
• 敲低 Fbxo32 减轻 LPS 诱导的大鼠心肌细胞线粒体功能障碍和凋亡：体内实验中，心肌原位注射携带 Fbxo32 shRNA 的 AAV9 敲低 Fbxo32 表达，TUNEL 检测显示心肌细胞凋亡率显著降低，western blotting 检测发现凋亡相关蛋白水平改变，TEM 观察到线粒体形态明显改善。
• 敲低 Fbxo32 减轻 LPS 诱导的心脏损伤和功能障碍：右颈总动脉插管测量血流动力学参数，发现敲低 Fbxo32 后，左心室最大收缩速率（± dp/dt_max）和左心室收缩压（LVSP）升高，左心室舒张末期压力（LVEDP）降低；血清中心肌损伤标志物、炎症标志物和心功能标志物水平也显著降低，HE 染色进一步证实了敲低 Fbxo32 对心肌损伤的保护作用。
• 敲低 Fbxo32 促进 PI3K/AKT 信号通路激活：western blotting 检测发现，敲低 Fbxo32 后，体外 LPS 处理的 H9c2 细胞和体内 LPS 处理的大鼠心肌组织中，磷酸化 PI3K（p-PI3K）和磷酸化 AKT（p-AKT）的蛋白水平均升高，表明 FBXO32 敲低促进了 PI3K/AKT 信号通路的激活。
• FBXO32 促进 ANXA1 的泛素化和降解：通过免疫共沉淀和质谱（CoIP-MS）技术筛选出与 FBXO32 相互作用的蛋白 ANXA1，进一步研究发现，LPS 刺激下，FBXO32 通过泛素 - 蛋白酶体途径促进 ANXA1 的降解，且 FBXO32 与 ANXA1 直接结合，敲低 Fbxo32 可减少 ANXA1 的泛素化水平，延长其半衰期。
• FBXO32 通过 ANXA1 调节 LPS 诱导的细胞凋亡和线粒体功能障碍：在 Fbxo32 敲低的 H9c2 细胞中进一步敲低 Anxa1 进行挽救实验，结果显示，细胞活力、凋亡率、ROS 水平、线粒体膜电位以及 PI3K/AKT 信号通路的激活情况均发生逆转，表明 ANXA1 是 FBXO32 的作用靶点，FBXO32 可能通过增强 ANXA1 的泛素化和降解促进 LPS 诱导的心肌细胞凋亡。

研究结论表明，FBXO32 在大鼠 LPS 诱导的心脏损伤模型中表达上调，通过与 ANXA1 相互作用，增加 ANXA1 的泛素化并促进其降解，进而抑制 PI3K/AKT 信号通路，最终促进心肌细胞凋亡。这一发现揭示了 FBXO32 是 LPS 诱导的心脏损伤细胞凋亡的重要调节因子，为 SIC 的治疗提供了潜在的新靶点。不过，该研究也存在一定局限性，如 LPS 诱导的 SIC 模型不能完全模拟人体病理生理状态，FBXO32 与 ANXA1 的具体结合位点还需进一步研究。但总体而言，这项研究为深入理解 SIC 的发病机制和开发新的治疗策略奠定了坚实基础，有望为 SIC 患者带来新的希望。