杨树杂交育种新突破：叶片活体接种法高效评估茎溃疡病抗性

《Plant Methods》：A rapid and efficient in vivo inoculation method for introducing tree stem canker pathogens onto leaves: suitable for large-scale assessment of resistance in poplar breeding progeny

为解决杨树杂交育种中抗性筛选难题，研究人员开展叶片接种 Valsa sordida 的研究，发现该方法可有效评估抗性，适用于大规模筛选。

　　# 杨树育种新突破：叶片接种法助力抗性评估
在广袤的森林中，杨树作为常见树种，却常常遭受各种病原体的侵袭，其中茎溃疡病的两大病原菌 —— 葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）和污黑腐皮壳菌（Valsa sordida）尤为猖獗。它们如同隐藏在暗处的杀手，肆意破坏着杨树的幼苗和成熟树林，给林业生产带来巨大损失。

传统的杂交育种是防治杨树病害的重要手段，然而，现有 “体外茎段接种法” 却成为了育种路上的绊脚石。该方法不仅耗费大量时间、空间，成本高昂，而且受接种材料限制，无法快速、高效且低成本地筛选所有杂交克隆的抗性，严重制约了杨树抗病品种的培育。为了打破这一困境，中国林业科学研究院的研究人员挺身而出，开展了一项极具意义的研究，相关成果发表在《Plant Methods》上。

研究人员另辟蹊径，提出了一种全新的 “叶片活体接种法”。他们选用已鉴定的杨树溃疡病菌 V. sordida 分离株 CZC 及 13 株葡萄座腔菌分离株，以 1 - 2 年生美洲黑杨 × 欧洲黑杨‘博丰 3 号’、6 年生银白杨变种新疆杨及 2 年生杂交克隆（美洲黑杨 × 美洲黑杨，48 个基因型）的树苗为材料。

在接种方法上，根据叶片大小，在选定叶片上接种 2 - 4 块带菌丝的 PDA 培养基方块，接种位置精心选择在叶片上表面距中脉 1 - 3cm 处，避开二级叶脉，之后用胶带密封固定，再在叶片下表面针刺 5 个点。实验设置了不同的处理组，包括对比不同叶龄叶片的抗性、光照和遮光条件下叶片的抗性，以及不同培养时间的病原菌对叶片致病性的差异等。同时，研究人员还通过体外茎段接种法对部分杂交克隆进行验证，并利用叶片接种法测定茎溃疡病菌的致病性。

研究结果令人惊喜。茎溃疡病菌 V. sordida 接种 5 天后，在叶片上诱导出了扩展的坏死病斑，甚至形成了分生孢子器结构和分生孢子。在叶龄对抗性的影响方面，上部 5 - 7 叶的抗性明显高于中部 18 - 20 叶，这表明新成熟的叶片可能具有更强的抵御病菌能力；光照条件下，遮光处理的叶片病情更严重，说明光照不足会增加杨树叶片对病菌的易感性；而在病原菌培养时间上，4 天培养的幼龄菌丝接种物比 7 天培养的老龄菌丝接种物致病性更强。

在对 48 个杨树杂交克隆的研究中，叶片接种法成功揭示了它们对 V. sordida 的抗性多样性。根据叶坏死面积疾病指数，这些克隆被分为七个不同的抗性组。通过体外茎段接种法对 15 个克隆的验证发现，两种方法评估抗性的结果具有显著一致性。此外，叶片接种法还揭示了葡萄座腔菌不同分离株的致病性差异，部分分离株致病性强，而部分则致病性低或无致病性。

在讨论部分，研究人员指出，叶片接种法相比传统的茎段接种法具有诸多优势。该方法操作简便，能在短时间内获取大量数据，且对杨树生长和生理影响小，有助于育种人员快速实施多目标育种策略。同时，研究还发现叶片位置、光照条件以及病原菌培养时间等因素都会影响实验结果，这为后续研究提供了重要参考。不过，研究也存在一定局限性，例如需要进一步在更大规模的杨树群体中验证该方法的可行性。

总体而言，这项研究意义重大。“叶片活体接种法” 为杨树杂交育种提供了一种快速、高效、低成本且高通量的抗性评估方法，特别适用于大规模杂交杨树克隆的抗性筛选，在杨树茎溃疡病及其他相关病害的育种工作中具有广阔的应用前景。未来，随着研究的深入，有望将该方法与先进的育种技术相结合，深入挖掘育种资源，发现更多与抗性相关的基因、基因位点或基因模块，为培育更优质、更抗病的杨树品种奠定坚实基础。

研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先是病原菌的培养与准备，在特定条件下培养 V. sordida 和 B. dothidea 等病原菌；接着进行叶片活体接种和体外茎段接种，分别在叶片和茎段上进行精准接种操作；利用 ImageJ 软件对叶片坏死斑点进行图像分析，获取坏死面积等数据；通过 t 检验、方差分析（ANOVA）等统计方法对数据进行分析，从而得出可靠的实验结论。

研究人员通过对不同叶龄叶片接种 V. sordida，对比接种后的坏死面积、发病率和疾病指数，得出上部叶片抗性更强的结论。在光照条件实验中，对不同光照处理的叶片接种病菌，分析坏死面积和疾病指数，发现遮光会加重病情。针对病原菌培养时间的研究，用不同培养时间的病菌接种叶片，统计发病率、坏死面积和疾病指数，明确幼龄菌丝致病性更强。在杨树杂交克隆抗性评估中，对 48 个克隆叶片接种病菌，计算相关指标并进行统计分析，揭示了抗性多样性；通过对 15 个克隆进行体外茎段接种验证，对比两种方法的评估结果，证实了叶片接种法的有效性。在测定病原菌致病性时，对不同分离株接种叶片，分析坏死面积等数据，发现了病原菌致病性的差异。

综上所述，本研究成功建立并验证了叶片活体接种法在杨树茎溃疡病抗性评估中的有效性，为杨树杂交育种提供了创新方法，同时也为其他树种的病害研究和育种工作提供了新思路和参考依据。