利用电子自旋共振技术监测微藻全细胞产氢：揭示关键标志物及氧化还原机制

《JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry》：Electron spin resonance in microalgae whole-cells to monitor hydrogen production

为探究微藻产氢机制，研究人员用电子自旋共振（ESR）研究小球藻全细胞，发现Fe3?S4+?簇标志物，为深入研究奠定基础。

　　在能源领域，氢被视为极具潜力的清洁能源，而生物制氢，尤其是利用微藻产氢，备受关注。微藻能借助阳光和水，通过光合作用产生氢气，这一过程既环保又可持续。然而，目前在微藻产氢研究中，仍存在诸多难题。例如，对微藻产氢过程中分子层面的机制了解不足，尤其是当产氢达到最大时，细胞内的特殊状态难以精确解析。并且，缺乏有效的手段来监测微藻产氢过程中的关键变化，使得难以进一步优化产氢条件。在这样的背景下，来自意大利国家研究委员会等机构的研究人员，开展了利用电子自旋共振（ESR）技术监测微藻全细胞产氢的研究。他们的研究成果发表在《JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry》上，为深入理解微藻产氢机制提供了重要依据。
研究人员开展这项研究主要运用了以下关键技术方法：首先是细胞培养技术，将小球藻（Chlorella vulgaris，Cvu）g120 菌株分别培养至H2?非活性状态和H2?活性状态；其次是 ESR 技术，使用 X 波段连续波 ESR 对不同状态的细胞进行表征；最后是 ICP-OES 测量技术，用于测定细胞中金属元素的含量。
下面来看看具体的研究结果：

1. 全细胞 ESR 光谱：研究人员对不同状态的小球藻细胞进行 ESR 光谱分析。在光谱中，观察到了Mn2+离子的信号（Mn2信号）、高自旋Fe3+离子的信号（Fe3hs信号）以及一种自由基物种的信号（rad信号）。通过比较H2?非活性状态（I2）和H2?活性状态（A2）的光谱，发现两种状态的差异主要体现在这些信号的相对强度上。同时，研究还发现光照时间对 ESR 光谱有显著影响。在 2 小时光照后的样品（A1）中，出现了一个位于g=2.02的信号，初步推测该信号与铁硫（FeS）簇有关。随着光照时间延长至 10 小时（A2 样品），FeS信号消失，rad信号强度增加。
2. 信号的温度依赖性和饱和行为：研究人员进一步研究了 A1 样品中信号的温度依赖性和饱和行为。结果表明，rad信号在20?80K范围内持续存在，而FeS信号仅在20K时可检测到，这与体外对分离的FeS蛋白的研究结果一致。通过对Mn2和Fe3hs信号的饱和曲线分析，发现H2?活性状态和H2?非活性状态下，这两种信号的饱和行为没有显著差异，说明Mn2+和高自旋Fe3+物种的弛豫特性及其局部环境不受细胞状态的影响。
3. FeS信号的归属：根据现有文献对FeS簇的研究，研究人员将FeS信号初步归属于Fe3?S4+?簇。Fe3?S4+?是Fe4?S42+?被氧气氧化过程中的一个中间产物，其信号特征与实验中观察到的FeS信号相符。在产氢初期（2 小时低强度光照后），Fe3?S4+?信号强度最大，随着氧气含量增加，该信号强度下降。
4. 不同状态下细胞中 ESR 活性物种的浓度：通过 ICP-OES 测量，研究人员发现从H2?非活性状态（I2）到H2?活性状态（A2），细胞密度下降，但每个细胞内的Mn和Fe原子数量增加，且Fe的内化程度明显高于Mn。利用 ESR 光谱，研究人员还估算了不同状态下细胞中Mn2+离子和高自旋Fe3+离子的相对含量。结果表明，H2?活性细胞中Mn2+离子的数量是H2?非活性细胞的 1.4 - 1.6 倍，而高自旋Fe3+离子的含量在产氢早期（A1 样品）是H2?非活性细胞的一半，在产氢后期（A2 样品）则发生反转。
   在研究结论和讨论部分，研究人员首次利用 ESR 光谱对有前景的产氢小球藻 g120 菌株的全细胞进行观察，在不同产氢阶段获得了有价值的光谱信息。通过对光谱的分析，结合现有文献，将一种特殊的信号归属于Fe3?S4+?簇。这一发现不仅有助于理解铁硫簇在细胞氧化还原条件变化时的作用机制，还表明Fe3?S4+?物种可作为一种瞬态缓冲物质，参与到Fe4?S42+?簇的形成过程中，进而影响 [FeFe] 氢化酶的成熟和活性。此外，该研究在实验过程中无需严格的厌氧条件和手套箱等设备，在N2?气流下制备细胞即可，这为后续研究提供了便利。研究结果还将为进一步利用其他光谱和显微镜技术，深入分析全细胞测量以及细胞环境变化奠定基础，有望推动微藻产氢领域的发展，为实现高效、可持续的生物制氢提供理论支持。