PI(3,4,5)P3介导 Cdc42 激活调控巨噬细胞足小体组装：解开细胞迁移的关键密码

《Cellular and Molecular Life Sciences》：PI(3,4,5)P3-mediated Cdc42 activation regulates macrophage podosome assembly

为解决巨噬细胞足小体组装中 PI (3,4,5) P3和 Cdc42-GTP 激活 WASP 的机制问题，研究人员开展 PI (3,4,5) P3介导 Cdc42 激活调控巨噬细胞足小体组装的研究，发现 PI (3,4,5) P3可招募 VAV1 激活 Cdc42，促进足小体组装和细胞迁移，为相关研究提供重要依据。相关成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》上。

　　

在细胞的微观世界里，巨噬细胞就像一群忙碌的 “免疫卫士”，时刻在结缔组织中穿梭巡逻，抵御病原体的入侵。巨噬细胞要高效地完成免疫任务，离不开一种特殊的结构 —— 足小体（podosome）。足小体就像细胞的 “小脚丫”，帮助巨噬细胞附着并在细胞外基质中移动。它的核心区域有密集聚合的丝状肌动蛋白（F-actin），这些 F-actin 的聚合受到多种调节因子的精密调控，其中 Wiskott-Aldrich 综合征蛋白（WASP）起着关键作用。WASP 能促进 Arp2/3 依赖的分支状肌动蛋白聚合，就像一个 “建筑大师”，搭建起足小体的 “骨架”。

然而，在这个微观的 “建筑工程” 中，还有许多谜团等待解开。虽然已知磷脂酰肌醇 - 3,4,5 - 三磷酸（PI (3,4,5) P₃）和结合鸟苷三磷酸的细胞分裂周期蛋白 42（Cdc42-GTP）是触发 WASP 介导的肌动蛋白聚合的重要因素，但它们激活 WASP 的具体因果机制却不清楚。这就好比知道了建筑图纸上有几个关键元素，却不明白它们是如何协同工作让建筑拔地而起的。这种机制的不明确，限制了人们对巨噬细胞免疫功能以及相关疾病发生发展过程的深入理解。为了揭开这些谜团，香港大学李嘉诚医学院生物医学学院（School of Biomedical Sciences, Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong）的研究人员 Yaoyue Qi 和 Cheng-han Yu 开展了一项关于 “PI (3,4,5) P₃介导 Cdc42 激活调控巨噬细胞足小体组装” 的研究，相关成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》上。

研究人员采用了多种关键技术方法来开展研究。通过实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析不同细胞中 Cdc42 鸟嘌呤交换因子（GEF）的表达情况；利用质粒转染技术构建并转染相关质粒，观察蛋白的定位和功能变化；运用蛋白质免疫印迹法（Western blot analysis）检测蛋白表达和活性水平；借助免疫荧光（immunofluorescence）和荧光显微镜（fluorescence microscopy）技术直观观察细胞内分子的分布和动态变化；还使用了明胶降解实验（gelatin degradation assay）和 Transwell 实验（transwell assay）评估巨噬细胞的功能。

研究结果如下：

• WASP-Cdc42 相互作用对足小体组装至关重要：研究人员通过全内反射荧光显微镜（TIRF microscopy）观察到，野生型 WASP 和 F-actin 在 THP-1 单核细胞来源的巨噬细胞足小体核心区域富集。构建的 Cdc42 结合缺陷型突变体 WASP-3D 虽也能出现在足小体核心，但与 F-actin 的相关性较弱，且无法像野生型 WASP 那样支持足小体组装。在 WASP 基因敲低的巨噬细胞中，足小体组装、明胶降解和细胞迁移能力均受到抑制，而重新引入野生型 WASP 可恢复这些功能，表明 WASP 与 Cdc42 的结合对足小体组装不可或缺。

• PI(3,4,5)P₃生成提升足小体处 Cdc42-GTP 水平：利用基因编码的生物传感器，研究人员发现 GFP-wGBD（一种可报告 Cdc42-GTP 空间分布的传感器）和 PH-Grp1（一种 PI (3,4,5) P₃特异性探针）均在足小体核心聚合的 F-actin 处富集，PIK3CB（PI3K 在 THP-1 巨噬细胞中的主要亚型）也存在于足小体核心。抑制 Cdc42-GTP（使用 ML141）、敲低 PIK3CB 或表达显性负性 Cdc42-T17N 突变体，均会阻碍足小体组装；而敲低 PIK3CB 会导致 Cdc42-GTP 水平下降，说明 PI (3,4,5) P₃的生成是促进 Cdc42-GTP 水平上升的上游信号。

• VAV1 是巨噬细胞中关键的 PI (3,4,5) P₃依赖的 Cdc42 GEF：研究人员对比了单核细胞和巨噬细胞中 Cdc42 GEF 的表达谱，发现 VAV1 等部分 GEF 在巨噬细胞分化后表达显著升高。进一步研究发现，在表皮生长因子（EGF）刺激 PI3K 激活后，VAV1 和 VAV3 能迅速招募到细胞膜，而其他候选 GEF 则无此现象。由于 VAV1 表达更高，研究人员重点研究其功能。

• 敲低 VAV1 抑制巨噬细胞足小体组装：在野生型 THP-1 巨噬细胞中，内源性 VAV1 主要与足小体核心的 F-actin 共定位。敲低 VAV1 后，巨噬细胞失去明显的点状 F-actin 组装，足小体阳性细胞数量和 Cdc42-GTP 水平显著降低，表明 VAV1 是促进巨噬细胞足小体组装的关键因素。

• VAV1 的膜结合和 GEF 活性对足小体组装及细胞迁移至关重要：构建 VAV1 的 GEF 失活突变体 GFP-VAV1-E201A 和膜结合缺陷突变体 GFP-VAV1-W495L，将它们分别导入 VAV1 基因敲低的 THP-1 巨噬细胞中。结果显示，野生型 VAV1 能恢复足小体组装、明胶降解和细胞迁移能力，而两种突变体则无法恢复。此外，膜结合缺陷突变体 VAV1-W495L 中关键的 GEF 活性指标 Y160 的磷酸化水平显著降低，说明具有功能 GEF 结构域且与膜结合的 VAV1 对巨噬细胞的生理活动至关重要。

研究结论表明，PI (3,4,5) P₃由 PIK3CB 介导生成，是招募 VAV1 到细胞膜的上游信号，激活的 VAV1 促进 Cdc42-GTP 水平上升，进而与阴离子脂质共同激活 WASP 介导的足小体组装，推动巨噬细胞的趋化迁移。该研究明确了 PI (3,4,5) P₃与 Cdc42-GTP 之间的因果关系，确定了 VAV1 在这一信号通路中的关键作用，为深入理解巨噬细胞的免疫功能提供了重要依据。同时，研究还发现 VAV1 在不同细胞中的功能存在差异，其在巨噬细胞足小体组装中的作用具有特异性。这一成果有助于揭示细胞骨架重组和侵袭性细胞迁移的总体机制，为相关疾病的研究和治疗提供了新的思路和潜在靶点。