Overexpression of lef5 Gene: A Breakthrough in Enhancing Exogenous Protein Stability in AcMNPV

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Enhancement of exogenous protein stability in AcMNPV by overexpressing lef5 gene during passaging

为解决杆状病毒表达载体系统（BEVS）中外源蛋白表达不稳定问题，研究人员开展 lef5 基因过表达对其影响的研究，发现 lef5 过表达可增强外源基因和蛋白表达稳定性，为优化 BEVS 提供依据。

　　在生命科学的微观世界里，病毒与细胞的 “互动” 影响深远。杆状病毒表达载体系统（BEVS）是生物技术领域的 “明星”，在疫苗开发和生产中占据重要地位。它就像一个高效的 “蛋白质工厂”，能在昆虫细胞中生产出带有真核生物修饰的蛋白质，许多人用和兽用亚单位疫苗，如人乳头瘤病毒（HPV）疫苗 Cervarix? 、流感疫苗 Flublok 等都借助这一技术诞生。

然而，BEVS 也有自己的 “烦恼”。在昆虫细胞中连续传代时，杆状病毒容易 “变异”，产生缺陷病毒（DIs），导致外源蛋白表达不稳定，就像工厂生产的产品质量参差不齐，严重影响了疫苗等生物制品的生产效率和质量。在表达像腺相关病毒（AAV）这样多基因的产品时，稳定性问题更是突出。

为了解决这些难题，武汉生物制品研究所有限责任公司和联合疫苗国家工程技术研究中心的研究人员踏上了探索之旅。他们聚焦于 lef5 基因，开展了一系列研究，相关成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上。

研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞和病毒培养方面，选用 Sf9 昆虫细胞系，培养并保存 AcMNPV 作为亲本病毒。通过构建重组杆状病毒，利用 qPCR 技术测定病毒滴度和基因拷贝数，以此评估病毒的生长和基因稳定性；采用免疫荧光测定（IFA）和 Western 印迹技术，检测蛋白表达情况。

在研究结果部分，首先是重组 AcMNPV 的构建。研究人员构建了一系列表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）或肠道病毒 71 型病毒样颗粒（EV71-VLPs）的重组 AcMNPV。如将 eGFP 基因克隆到 pBacT 载体，在 vp39 启动子控制下构建 pBacT-eGFP 质粒，再引入 lef5 基因构建不同质粒，转染 Sf9 细胞获得相应重组病毒；以类似方法构建表达 EV71-VLPs 的重组病毒。

其次是不同启动子对 lef5 基因转录的影响。研究发现，op166 启动子启动 lef5 基因转录更早，感染第一天，在表达 eGFP 和 EV71-VLPs 的重组 AcMNPV 中，其驱动的 lef5 转录水平显著增强；而 p10 启动子启动效果更强，感染第二天起，它驱动的 lef5 转录水平显著高于其他组。不过，在表达 EV71-VLPs 的重组 AcMNPV 中，各组 lef5 转录水平差异不明显。

然后是 lef5 基因对 eGFP 基因和蛋白表达稳定性的影响。在重组 AcMNPV 连续传代过程中，研究人员发现随着传代次数增加，AcGFP 中 eGFP 基因拷贝数从第 11 代开始显著下降，蛋白表达也相应减少，且低接种比例时更明显。而引入 lef5 基因后，在 p10 和 op166 启动子控制下，eGFP 基因和蛋白表达稳定性显著增强，其中 AcGFP-p10-lef5 中 eGFP 蛋白表达衰减最慢。

最后是 lef5 基因对 EV71-P₁基因表达和蛋白加工的影响。对于表达 EV71-VLPs 的重组 AcMNPV，连续传代时 AcEV71 中 EV71-P₁基因会丢失，且比 eGFP 基因更严重。引入 lef5 基因后，显著提高了 EV71-P₁基因稳定性。免疫荧光和 Western 印迹分析表明，lef5 基因不仅增强了 EV71-P₁基因表达稳定性，还促进了 P₁蛋白的切割，有助于 EV71-VLPs 的形成。

研究结论和讨论部分指出，lef5 基因过表达显著增强了外源基因如 eGFP 和 EV71-P₁的遗传稳定性和蛋白表达稳定性。启动子的选择对 lef5 基因转录和外源蛋白表达稳定性影响重大，op166 启动子更有利于复杂外源蛋白如 EV71-VLPs 的表达稳定，p10 启动子则对简单外源蛋白 eGFP 的表达稳定作用更明显。此外，研究还发现低接种比例时基因缺失病毒积累更快，但 lef5 基因对病毒复制稳定性的影响不受接种比例限制。

这项研究意义非凡，它不仅揭示了 lef5 基因在增强 BEVS 中外源蛋白长期表达稳定性方面的关键作用，尤其是在生产像 VLPs 这样的复杂蛋白时优势明显；还为优化杆状病毒表达系统提供了宝贵策略，有助于提高生物技术产品生产的效率和可靠性，为未来疫苗开发和生物制品生产开辟了新道路。