定量解析甲型流感病毒在不同宿主细胞内的蛋白动态变化：种子病毒适应后的新发现

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Quantification of intracellular influenza A virus protein dynamics in different host cells after seed virus adaptation

为探究甲型流感病毒（IAV）在不同宿主细胞中的复制差异，研究人员开展 IAV 蛋白定量研究，发现病毒适应可改变蛋白拷贝数和病毒滴度，有助于优化疫苗生产。

　　

流感病毒研究：探索病毒与细胞的奥秘

在人类与病毒的漫长斗争史中，流感病毒始终是个难缠的 “对手”。它不仅频繁引发大规模疫情，给人类健康带来沉重打击，还对农业经济造成严重破坏。近年来，高致病性 H5N1 病毒感染奶牛的事件，更是给我们敲响了警钟。目前，流感疫苗是预防和控制流感传播的重要手段。传统上，流感疫苗多通过鸡胚培养生产，但这种方法存在诸多局限性，比如生产周期长、难以大规模快速响应疫情等。动物细胞培养技术作为一种新兴的替代方法，具有诸多优势，如能缩短大流行时的生产周期、便于大规模生产、免疫原性良好等，成为了研究的热点。

然而，在利用动物细胞培养生产流感疫苗的过程中，仍存在许多未知。不同的细胞系对流感病毒的生产效率差异很大，例如 MDCK 细胞的病毒产量较高，而 HEK293 细胞和 AGE1.CR 细胞的产量相对较低，但其背后的原因却并不清楚。此外，病毒在细胞内的复制过程极为复杂，涉及多种病毒蛋白和宿主细胞因子的相互作用，目前对这些过程的了解还不够深入。而且，现有的数学模型在描述病毒复制动态时，多基于病毒滴度和 RNA 数据，对病毒蛋白生产的定量数据却非常匮乏。因此，深入研究流感病毒在不同宿主细胞内的复制机制，尤其是病毒蛋白的动态变化，对于优化疫苗生产工艺、提高疫苗产量和质量具有重要意义。

为了攻克这些难题，来自德国多个研究机构（Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems、Otto von Guericke University Magdeburg、ProBioGen AG、Anhalt University of Applied Sciences）的研究人员携手合作，在《Applied Microbiology and Biotechnology》杂志上发表了一项重要研究成果。他们通过优化质谱分析方法，对甲型流感病毒（IAV）在不同宿主细胞内的蛋白动态变化进行了深入研究。

研究技术方法

研究人员采用了多种关键技术。在细胞培养方面，选用了 MDCK、HEK293 和 AGE1.CR 三种适应悬浮生长的细胞系，分别在特定培养基中培养。病毒感染时，使用了三种不同的甲型流感 A/PR/8/34（H1N1）种子病毒，并对部分种子病毒进行了细胞适应性传代。在分析检测上，运用了自动细胞计数系统测定细胞浓度、活力和直径；通过血凝（HA）试验和半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）试验监测病毒生产；利用绝对蛋白定量技术结合质谱（MS）分析，对 IAV 的五种主要蛋白（HA、NP、NA、M1 和 NS1）进行定量。

研究结果

1. IAV 蛋白生产可定量监测：研究人员改进了 IAV 蛋白绝对定量的工作流程，提高了检测的灵敏度、准确性和精密度，将检测的动态范围从 1 - 2 个数量级提升到 3 - 4 个数量级。在 MDCK.Xe.E 细胞感染实验中，发现所有五种 IAV 蛋白在感染后 10 小时内均可被定量。感染初期，NS1 蛋白无法检测到，HA、NA 和 NP 蛋白水平相似，M1 蛋白水平较高。随着感染进程，蛋白表达呈指数增长，10 小时时，NS1 蛋白成为最丰富的 IAV 蛋白。此外，细胞外病毒滴度的增加与细胞内蛋白表达动态相似，且基于 qPCR 的病毒浓度估计比基于 HA 试验的结果高约 7.5 倍。
2. 种子病毒适应 AGE1.CR 细胞的影响：在 AGE1.CR 细胞感染实验中，使用非适应种子病毒时，感染初期五种 IAV 蛋白均无法在细胞内检测到，且蛋白生产水平较低，感染周期内蛋白浓度仅增加 2 个数量级。种子病毒适应后，NS1 和 HA 蛋白拷贝数显著增加，NA 蛋白拷贝数也有所增加，但 HA 滴度的最大值变化不大。
3. 种子病毒适应 HEK293 细胞的影响：在 HEK293 细胞感染实验中，使用非适应种子病毒时，蛋白表达动态与 MDCK.Xe.E 细胞相似，但病毒颗粒在 6.5 小时后才在细胞外被检测到。种子病毒适应后，大多数 IAV 蛋白的细胞内拷贝数增加，尤其是 NS1 蛋白，且病毒感染和释放似乎更高效，HA 滴度在 12 小时时增加了约三倍。
4. 种子病毒适应对病毒粒子比例的影响：综合比较不同细胞系，MDCK.Xe.E 细胞产生的 HA 滴度最高。种子病毒适应后，AGE1.CR 和 HEK293 细胞中总病毒粒子与感染性病毒粒子的比例下降，这表明病毒适应可能提高了病毒粒子的组装效率。

研究结论与意义

这项研究通过优化的质谱方法，对不同宿主细胞和种子病毒感染情况下的 IAV 蛋白动态进行了全面的定量分析。研究结果表明，宿主细胞的先天免疫反应、病毒蛋白生产、前体消耗和降解速率等因素，都会影响 IAV 的复制。种子病毒适应能够改变细胞内病毒蛋白的拷贝数，提高病毒感染和释放的效率，这对于理解病毒在不同细胞系中的复制机制具有重要意义。同时，研究还发现不同细胞系中病毒蛋白的表达比例与病毒粒子中的比例存在差异，这为进一步优化疫苗生产工艺提供了理论依据。未来，研究人员计划通过建立更详细的数学模型，深入探讨病毒复制的机制，这将有助于推动基于细胞培养的流感疫苗生产技术的发展，为应对流感疫情提供更有效的手段。