基于化学发光检测 dATP 消耗的 Phi29 DNA 聚合酶活性绝对定量新方法：突破传统局限，引领酶活性检测新方向

《Analytica Chimica Acta》：A safety and absolute activity measurement method for Phi29 DNA polymerase based on chemiluminescent detection of dATP consumption

来自国内的研究人员为解决传统 Phi29 DNA 聚合酶活性评估方法的局限，开展相关研究，开发出基于化学发光的绝对定量法，为酶质量控制提供新基准。

　　Phi29 DNA 聚合酶（Phi29 DNA polymerase）是分子生物学中的关键酶，在滚环扩增（rolling - circle amplification）、多链置换扩增（multiple strand - displacement amplification）、单分子实时测序（single - molecule real - time sequencing）等重要应用中发挥着基石作用。尽管它应用广泛，但传统检测其活性的方法，像放射性标记和基于荧光的定量技术，存在操作复杂、精度低和安全风险等问题，这在学术和工业环境中都阻碍了标准化的质量控制。

为应对这些局限，研究人员开发了一种基于化学发光的绝对定量方法，该方法能直接测量聚合过程中 dATP 的消耗情况。在 Phi29 DNA 聚合酶沿着双链环状 DNA 模板进行互补聚合时，通过检测 dATP 的消耗（CDC - dATP）来实现。由于引物链的持续延伸伴随着 dATP 的消耗，而在 dATP 存在的情况下，荧光素（Luciferin）会发生氧化反应。荧光素分子内形成过氧桥，氧化过程中释放一分子二氧化碳，能量以荧光形式释放。当萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和荧光素过量时，特定浓度范围内产生的荧光与 dATP 浓度成正比。利用荧光光谱仪测量荧光素氧化时发出的荧光，就能确定剩余 dATP 的量，进而计算出 DNA 聚合过程中消耗的 dATP 量，以此反映 Phi29 DNA 聚合酶的绝对活性。

此方法简化了操作流程，无需多步纯化程序或专用设备，2 小时内就能完成 Phi29 DNA 聚合酶活性的定量检测。它在较宽的动态范围（25 - 200 μg/mL）内具有良好的线性和灵敏度，并且用基于化学发光的 dATP 检测取代了³H 标记的 dTTP，消除了放射性物质带来的生物危害风险，更便于常规实验室使用。

该研究还指出，不同样本的碱基组成差异会影响聚合活性测量结果，不同序列的双链 DNA 模板可能形成不同的二级结构。Phi29 DNA 聚合酶在约 30°C 时活性最佳，这个温度无法通过热变性消除结构差异，所以 DNA 模板的选择会影响聚合酶活性测量的准确性。为此，研究人员将 pET - 28a (+) 双链 DNA 标准化作为实验模板，为建立 Phi29 DNA 聚合酶或其他 DNA 聚合酶的活性检测方法提供了基础框架。不同的模板可能会使酶对 dNTP 掺入的最终定量结果有所不同，但研究人员相信该方法具有普遍适用性。

与其他酶活性检测技术相比，CDC - dATP 方法将发光检测与剩余 dATP 相结合，实现了绝对定量，避免了放射性标记的危害。由于发光检测试剂灵敏度高、线性范围广，该方法的线性范围和灵敏度都有所提升，且两步反应无需对产物 DNA 进行纯化，避免了因纯化产率不稳定导致的准确性干扰。这一突破解决了现有 Phi29 DNA 聚合酶活性检测方法存在的问题，为确定 Phi29 DNA 聚合酶的活性提供了有价值的参考，同时对测定其他涉及 dATP 或 ATP 生成与消耗的酶的绝对活性也具有重要的应用价值。

研究使用的材料和试剂包括从 New England Biolabs（NEB）和 GenEasy Biotechnology Co. Ltd. 购买的 Phi29 DNA 聚合酶，从Escherichia coli中利用质粒提取试剂盒提取的 pET - 28a (+) 质粒 DNA，以及从 Takara Biotechnology（Beijing）Co. Ltd. 购买的 dNTP 混合物和 Enhanced ATP Assay Kit。研究还对 Enhanced ATP Assay Kit 针对不同 dNTP 的特异性进行了测试，结果显示 0.7 mM dATP 能产生较高的发光值，而相同浓度的 dGTP、dCTP 和 dTTP 发光响应微弱。

总之，该研究开发出了一种操作简便、准确的 Phi29 DNA 聚合酶活性绝对定量方法，它灵敏度高、稳定性强、选择性好，克服了现有检测方法存在的放射性污染、操作复杂和定量不准确等问题。