纳米级弱亲和色谱 - 质谱联用技术：膜蛋白片段药物筛选的创新之钥

《Analytica Chimica Acta》：Development of ultra-miniaturized weak affinity chromatography coupled to mass spectrometry as a high throughput fragment screening method against wild-type and purified membrane proteins embedded in biomimetic membranes

为解决膜蛋白在片段药物发现中的难题，法国研究人员开展纳米 WAC-MS 筛选研究，可快速筛选弱结合片段，具重要意义。

　　在蛋白质组中，膜蛋白约占 30%，它们是重要的药物靶点。但在药物研发过程中，膜蛋白面临诸多挑战，比如生产速率有限、纯的且功能折叠的蛋白质最终产量较低，在水相介质中不稳定等。在基于片段的药物发现（FBDD）领域，这些问题更为严峻，因为缺乏有效的方法快速筛选片段与蛋白质之间的弱相互作用，阻碍了潜在药物候选物的发现。

在这项研究中，研究人员提出将微型化弱亲和色谱与质谱联用（nano-WAC-MS），这是一种创新策略，用于快速筛选能与选定膜蛋白弱结合的片段。研究人员把一种整合膜蛋白（A_2AR）整合到生物素化的纳米圆盘（nanodiscs）中，随后将其固定在微型整体式链霉亲和素柱（内径 75μm，体积 300nL）上。对这些微型亲和柱（每个柱子消耗的蛋白量少于 1μg）与质谱（多反应监测模式，MRM mode）的联用进行优化，扩大了低亲和力检测范围并提高了通量，使得单次分析能进样 150 个片段，且二甲基亚砜（DMSO）含量高达 10% 时也不影响亲和力。通过对比片段在目标柱和用空纳米圆盘制备的对照柱上的保留时间，来识别阳性片段（hits）。

研究人员将此次筛选结果与核磁共振（NMR）得到的结果进行比较，并用竞争实验或前沿亲和实验对新发现的阳性片段加以验证。研究显示，这种基于纳米圆盘的策略为蛋白质提供了稳定且类似天然的脂质环境（柱子可使用数天），并且该策略也适用于其他整合在纳米圆盘里的膜蛋白。

FBDD 是 20 世纪 90 年代出现的药物研发方法，已成功助力发现多种治疗分子，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的 7 种药物就运用了该方法。FBDD 基于结构导向，使用小分子库（低分子量，小于 300Da 的分子，即 “片段库”）对目标蛋白进行初步筛选，找出有治疗开发潜力的结合片段（“阳性片段”）。由于这些片段尺寸小，与目标蛋白的亲和力较弱（在毫摩尔到微摩尔范围），之后需要依据结合位点的结构知识，通过连接、桥接或生长等方式，将其转化为高亲和力配体（“类药分子”）。目前已有多种生物物理技术用于片段筛选，但针对膜蛋白的片段筛选面临诸多困难，比如膜蛋白产量低、提取纯化需要特定表面活性剂、最终纯品和功能折叠蛋白产量低、在水相介质中不稳定等。已有的针对膜蛋白的片段筛选方法多依赖对蛋白进行人工修饰来提高其在水溶液中的稳定性，但这种方法既耗时又可能影响蛋白的结构和动态特性。

研究人员开发的 nano-WAC-MS 技术，专为在水溶液中处理膜蛋白的特异性而设计，能以快速筛选的形式，使用少量未修饰的蛋白（保持无偏向的构象状态）进行实验。此前有研究将弱亲和色谱 - 质谱联用技术应用于膜蛋白筛选，但存在一些不足，本研究团队在此基础上进行改进，设计出 nano-WAC 柱，采用内径 75μm 的毛细管和亲水整体固定相，用于定向固定稳定在纳米圆盘（模拟生物膜）中的野生型、纯化膜蛋白。纳米圆盘由磷脂和两亲性蛋白（膜支架蛋白，MSP）协同组装而成，能防止膜蛋白暴露在水环境中，从而克服其不稳定性。纳米圆盘的脂质分子在水相中自组装成双层结构，MSP 包裹在脂质双层边缘起到稳定作用，这种双层结构模拟细胞膜环境，让膜蛋白能在接近天然的状态下保持活性和功能。此外，通过生物素化的 MSP 固定纳米圆盘时，膜蛋白的胞内和胞外表面都能与相互作用的分子接触。由于只有包裹纳米圆盘的 MSP 是生物素化的，目标蛋白保持完全天然状态，该方法具有通用性，可直接应用于任何重组在纳米圆盘里的膜蛋白。这种固定方法大幅降低了膜蛋白的消耗量，制备一根表面蛋白密度高的微型柱，只需亚微克量的膜蛋白（例如 8 厘米长的柱子约需 30pmol 膜蛋白）。相较于之前的研究，改进后的技术能检测低至几百微摩尔的亲和力，同时膜蛋白的消耗量减少了 3 - 4 倍。研究人员优化了 nano-WAC 柱与质谱联用的实验条件（流速、补充液、DMSO 含量等），旨在实现高通量筛选。优化后的条件用于对腺苷 A_2A受体（AA_2AR，一种典型的 A 类 G 蛋白偶联受体，GPCR）进行片段筛选。AA_2AR 不仅具有重要生物学意义，而且已知的配体众多，有利于新方法的开发和验证。筛选方法是对比携带受体纳米圆盘的 AA_2AAR 亲和柱与携带空纳米圆盘的对照柱上片段的保留时间，研究人员还评估了亲和柱和对照柱之间保留时间位移阈值的应用条件，以此确定阳性片段的检测方法。