新型 3D 水凝胶 - 纸基支架电化学免疫条传感器：耐药血流感染精准诊疗新希望

《Analytica Chimica Acta》：Electrochemical β-lactamase immunostrip sensor with 3D hydrogel-paper scaffold for rapid detection & post-antibiotic therapy monitoring in drug-resistant bloodstream infections

本文开发了一种新型电化学免疫条传感器，用于快速检测 β- 内酰胺酶（BL），助力耐药血流感染诊疗。

　　

摘要

背景：耐药菌引起的血流感染日益普遍，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染，给全球医疗带来严峻挑战。现有的诊断方法在及时性和敏感性上存在不足，难以满足及时进行抗生素干预的需求，还可能因广谱抗生素的滥用加剧耐药问题。而且，现有检测平台很少能同时实现快速检测、低检测限和实时治疗监测，在感染管理方面存在关键缺口。结果：本研究推出一种用于快速检测 β- 内酰胺酶（BL）的电化学免疫条传感器，该酶与耐药性相关。借助新型 3D 水凝胶 - 纸基支架，该传感器检测限低至 0.146 mU/ml，能从临床样本中精准检测出产生 BL 的病原体，包括 MRSA，即便样本中细菌载量低至 10² CFU/ml 也能有效检测。该平台在血培养后 1 小时内可给出检测结果，4 小时内就能对抗生素治疗效果进行监测，并且特异性高达 100%，能够准确区分产 BL 菌株和非产 BL 菌株。意义和创新性：本研究开发了一种集成 3D 水凝胶 - 纸基支架的新型电化学智能免疫条传感器用于 BL 检测，具备高灵敏度和高特异性。与传统诊断方法不同，它操作简便、检测快速、成本低廉，血培养后 1 小时内即可完成检测，4 小时就能实现实时抗生素治疗监测，为耐药血流感染的即时床旁（POC）诊疗管理带来变革。

引言

抗菌药物耐药性（AMR）是全球日益严峻的威胁，抗生素失效是主要原因。据预测，到 2050 年，AMR 每年可能导致 1000 万人死亡。世界卫生组织（WHO）已将其列为紧迫的全球威胁，急需关注。了解 AMR 的传播范围、全球不同地区的耐药模式以及主要的病原体 - 药物组合至关重要。若不采取严格措施，AMR 可能使病原体的危害性远超现在。根据 2022 年全球抗菌药物耐药性和使用监测系统（GLASS）报告，第三代头孢菌素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌无效，而这两种菌可引发多种细菌感染。因此，开发快速诊断工具对及时治疗、控制感染至关重要。

细菌中的 β- 内酰胺酶（BL）可通过水解抗生素中的 β- 内酰胺环，抵御 β- 内酰胺类抗生素，是检测多重耐药感染的理想生物标志物。传统检测 BL 的方法，如抗菌药物敏感性试验（AST，被视为金标准），耗时久，需要专业技术和复杂设备。其他表型检测方法，如纸片扩散法和最低抑菌浓度测定法，虽可靠但同样耗时。除了准确性，及时诊断也极为关键，诊断延误可能导致治疗延误，危及患者生命。一些分子技术，如聚合酶链式反应（PCR），灵敏度和特异性较高，能在一天内得出结果，但价格昂贵，普及受限。目前，比色法和荧光法等表型检测方法因原理简单受到关注。比色法虽通过颜色变化检测相对简便，但易出现假阳性，影响灵敏度；荧光法虽更灵敏，但需要精密仪器，在偏远和条件有限地区难以应用。

深入了解革兰氏阴性菌中 BL 的诱导机制，有助于开发快速诊断工具。BL 诱导主要有两种机制。AmpG-AmpR-AmpC 通路常见于大肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌，是细菌对 β- 内酰胺类抗生素产生耐药性的关键机制之一。AmpG 将肽聚糖分解产物转运到细菌细胞质中，激活转录调节因子 AmpR，促使 ampC 基因表达增加，该基因编码的 BL 可降解 β- 内酰胺类抗生素，帮助细菌在富含抗生素的环境中存活。BlrAB 样双组分调节系统也参与部分细菌 BL 表达的调控。其中，反应调节因子 BlrA 与特定 DNA 序列相互作用，调节编码 BL 的基因表达；组氨酸激酶 BlrB 可能感知环境信号或抗生素的存在，并将磷酸基团转移给 BlrA，激活其调节功能，最终影响 β- 内酰胺酶的表达，改变细菌对 β- 内酰胺类抗生素的耐药能力。这些通路为理解 AMR 药物的潜在靶点提供了思路，抑制 BlrA 和 BlrB 可能恢复细菌对抗生素的敏感性。此外，研究抗生素作用下细菌的动态进化，有助于开发能更好监测 AMR 传播范围的快速诊断工具。

抗生素检测是治疗药物监测（TDM）的关键部分，与 AMR 相关，可在患者治疗过程中实现精准靶向治疗。WHO 在 2019 年发布的需进行 TDM 的药物清单中列出了主要抗生素类别。过去，制药研究通过开发新抗生素应对耐药问题，2021 年 WHO 年度分析显示，有 27 种针对重点感染的新药处于临床研发阶段。在市售的抗生素检测传感器中，光学传感器占主导，而基于电化学的生物传感器相对较新。这些新兴设备因传统金标准技术和常规检测方法存在灵敏度低、运行成本高、准备工作复杂等局限，成为有力的替代选择。

电化学免疫分析是一种强大的分析技术，结合了抗原 - 抗体相互作用的特异性和电化学检测方法的灵敏度，因其高灵敏度、快速检测和操作简便，广泛应用于临床诊断、环境监测和食品安全领域。近年来，研究致力于通过添加金纳米颗粒、磁性纳米颗粒、普鲁士蓝纳米立方体等纳米材料，提高该分析方法的灵敏度和选择性。这些纳米材料增大了表面积与体积比，使选择性配体更易接触目标物，从而降低检测限，加快响应时间。此外，便携式和微型化电化学免疫传感器的发展，实现了床旁检测，使该分析方法在实际应用中更易获取和实用。总体而言，电化学免疫分析是一种精准、高效检测多种分析物的工具。

纸基水凝胶是一种创新材料，融合了水凝胶和纸张的特性。它通过化学交联、物理混合等技术合成，形成三维交联网络，能吸收大量水分。这种材料生物相容性好、亲水性强、柔韧性佳且可降解，适用于多种领域。在生物医学领域，可用于伤口敷料、药物控释系统和组织工程，因其能保持湿润、促进愈合；在环境监测中，可作为传感器检测污染物和病原体，利用纸张基底的灵活性和成本效益；在柔性电子领域，可用于开发可穿戴传感器和软机器人，得益于其机械强度和导电性。水凝胶与纸张的结合，为各科学和工业领域的先进材料发展开辟了新途径。

普鲁士蓝纳米立方体是一类具有独特性质和广泛应用的纳米材料，通常通过化学沉淀、水热合成等方法制备，可精确控制其尺寸和形态。普鲁士蓝纳米立方体具有出色的光热和催化性能，适用于光热治疗和多种化学反应的催化剂；还具有类过氧化物酶活性，可用于生物传感，特别是检测过氧化氢；其生物相容性和生物降解性良好，是抗菌治疗、活性氧清除等生物医学应用的理想材料。普鲁士蓝纳米立方体的多功能性推动了从储能到环境监测、医学诊断等多个领域的研究与发展。

任何检测方法的快速检测能力对耐药感染的管理和控制至关重要，可实现及时诊断和恰当治疗。结合基于纸 / 水凝胶支架的电化学免疫分析和普鲁士蓝纳米立方体，有助于快速检测耐药血流感染中的 BL。因此，本研究开发了一种智能电化学 BL 免疫条传感器，用于耐药血流感染的快速检测，检测限为 0.146 mU/ml，灵敏度和特异性高。该免疫传感器在不同细菌培养条件下进行评估，1 小时内即可快速筛查 BL。此外，该传感器集成 3D 水凝胶 - 纸基支架，用于抗生素治疗后的监测，这对了解感染阶段、确定合适的靶向治疗至关重要。研究还使用临床分离株对传感器进行验证，评估其在实际情况下的有效性。

材料和方法

实验均使用 25°C 时电阻率为 18.2 MΩ?cm 的 Milli Q 水，所用化学品均为分析纯，无需进一步处理。实验所需的亚铁氰化钾、氯化铁、柠檬酸、牛血清白蛋白（BSA）、羧甲基纤维素、琼脂糖、磷酸盐缓冲溶液（PBS）、曲拉通 X、吐温 - 20、碳酸氢钾、苯唑西林（5 mcg / 片）、头孢西丁（30 mcg / 片）以及 HiPer 抗体捕获 ELISA 试剂盒均购自印度 Hi-Media 公司，AST-P628 检测卡购自 bioMérieux 公司。

普鲁士蓝纳米立方体（PBNC）的表征及与抗体的结合

通过光谱和显微镜分析确定普鲁士蓝纳米立方体（PBNC）和 PBNC/BL 抗体（PBNC/BL-Ab）的结构组成。首先，采用紫外 - 可见分光光度法确认 PBNC 和 PBNC/BL-Ab 的形成。观察发现，PBNC 在 700 nm 处有最大吸收峰，表明形成了均匀的立方单分散纳米颗粒；而 PBNC/BL-Ab 由于 BL 抗体与 PBNC 结合，吸光度显著降低。

利用免疫条传感器直接检测阳性培养物中的 BL

文献报道，BL 在革兰氏阳性菌的细胞质中合成，随后转移到细胞表面，可能释放到细胞外空间。因此，BL 既可以在细胞表面检测，也可以在细胞内检测。为确定使用该传感器检测 BL 的最佳条件，实验在两种条件下进行。为检测细胞表面的 BL，对全细胞沉淀进行长达 16 小时的检测。

基于水凝胶的 3D 细胞培养

临床医生常需实时监测患者对抗生素治疗的反应，以便调整剂量和进行靶向治疗，改善患者预后。为此，研究开发了一种基于水凝胶的 3D 细胞培养系统，用于培养细菌分离株，以监测抗生素治疗后 BL 的变化。对开发的水凝胶进行了全面的 3D 细胞培养特性表征，通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和溶胀研究对水凝胶的形成进行表征。

利用免疫条传感器在水凝胶 - 3D 细胞培养中监测抗生素治疗后的 BL

设计了直径 0.8 cm、深度 1 cm 的 6 孔培养板，用于放置水凝胶支撑的纸基支架。实验流程如下：为模拟患者接受抗生素治疗后体内的抗生素应激反应，在体外使用青霉素（1 μl/ml）处理细菌，处理时间分别为 0 h、4 h、8 h 和 16 h，刺激 BL 的产生。处理后，将细菌细胞离心沉淀，检测细胞表面的 BL。

临床分离株检测

本研究旨在验证 BL 免疫条传感器能否直接检测 MRSA 临床样本中的 BL。使用智能手机应用程序 Beta Sense 检测阳性血培养中 BL 的工作流程如下：从印度达德拉和纳加尔哈维利、达曼和第乌联合属地的国家重点实验室和国家监测单位（IDSP）收集了 8 份血液样本，其中 6 份来自 MRSA 感染患者的回顾性样本，2 份来自其他样本。

结论

综上所述，研究开发了一种新型纸基水凝胶支撑的 BL 免疫条传感器，能够在 1 小时内从培养阳性的分离株中检测出 β- 内酰胺酶（BL）。此外，该传感器还可作为预后工具，在诱导后 4 小时即可进行抗生素治疗监测。借助 3D 纸基和水凝胶支架的独特特性，这种新检测方法提高了灵敏度和特异性，能够快速识别产 BL 细菌，在耐药血流感染的诊断和治疗监测中具有重要应用价值。

作者贡献声明

Malvika Shukla：撰写 - 评审与编辑、撰写 - 初稿、可视化、验证、软件、方法学、调查、形式分析、数据整理。Dhruvesh Maiya：可视化。Rimpal Malaviya：软件、方法学。Mruga Raval：验证、方法学。Dolatsinh Zala：监督、资源。Vaibhav Bhatt：监督、资源、项目管理。Shubhita Tripathi：验证、资源、项目管理。Alok Pandya：撰写 - 评审与编辑。

伦理声明

细菌在印度古吉拉特邦艾哈迈达巴德的古吉拉特技术大学（GTU）培养，获得了机构生物安全委员会（INST241220191120）的批准。涉及临床分离株和血液样本的研究与印度达德拉和纳加尔哈维利、达曼和第乌联合属地的国家重点实验室合作开展。

利益冲突声明

作者声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益和个人关系：Alok Pandya 博士报告称，印度高级研究学院提供了资金支持和行政支持。Alok Pandya 博士还报告称，古吉拉特邦生物技术使命提供了设备、药品、物资、统计分析、差旅和写作协助。若存在其他利益冲突情况，文中未提及。

致谢

Alok Pandya 感谢古吉拉特邦生物技术使命（GSBTM 项目编号：FLOWG8）的资金支持。同时感谢 Kartik Chauhan 先生在原型设计方面提供的帮助。