新冠病毒中和抗体 NT-108 的结构与功能解析：为治疗性抗体设计提供关键指引

《Communications Biology》：Structural and virological identification of neutralizing antibody footprint provides insights into therapeutic antibody design against SARS-CoV-2 variants

为探究新冠病毒中和抗体 NT-108 的作用机制，研究人员解析其结构，明确突变影响，助力抗体设计。

　　

研究背景

自新冠疫情爆发以来，严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）在全球范围内肆虐，给人类健康带来了巨大威胁。截至 2025 年 3 月 7 日，已有 777 亿人感染，710 万人不幸丧生 。由 SARS-CoV-2 感染引发的冠状病毒病 2019（COVID-19）持续蔓延，其常见症状包括发热、乏力和干咳。

SARS-CoV-2 携带的正链单链 RNA 基因组编码多种蛋白，其中刺突（Spike，S）蛋白在病毒感染宿主细胞的过程中起着至关重要的作用。Spike 蛋白形成同三聚体，包含 S1 和 S2 两个大结构域，在病毒成熟时，会被弗林蛋白酶（furin）等丝氨酸蛋白酶在 S1/S2 结构域之间的多碱性序列（682RRAR⁶⁸⁵）处切割。S1 结构域中的受体结合域（Receptor Binding Domain，RBD）能够与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶 2（Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2）结合，随后 S2’位点被跨膜丝氨酸蛋白酶 2（Transmembrane Protease Serine 2，TMPRSS2）等蛋白酶切割，从而实现病毒进入细胞。此外，还存在一种不依赖 furin 和 TMPRSS2 的内体途径，该途径利用组织蛋白酶 L 激活 Spike 蛋白。

针对 SARS-CoV-2 感染，开发了许多中和抗体用于治疗和预防。然而，新冠病毒的不断变异，如 Alpha、Beta、Delta 和 Omicron 等变异株的出现，这些变异株的 Spike 蛋白携带氨基酸突变，导致其能够逃避免疫反应，增加了感染性，给中和抗体和疫苗的研发带来了巨大挑战。此前研究报道的中和抗体 NT-108 具有强大的中和活性，但人们对其结构和功能基础知之甚少。因此，深入研究 NT-108 的作用机制，对于理解抗体识别机制、开发更有效的治疗性抗体和疫苗具有重要意义。

研究机构与研究概况

来自北海道大学、日本国立传染病研究所等多个研究机构的研究人员针对上述问题展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Communications Biology》杂志上，为治疗性抗体的设计提供了重要的理论依据。

研究人员运用了多种关键技术方法。在动物实验方面，选用叙利亚金黄地鼠作为动物模型，评估 NT-108 的体内抗病毒活性。在结构研究中，利用冷冻电镜（Cryo-EM）技术解析 NT-108 与 SARS-CoV-2 Spike 蛋白复合物的结构，同时结合 X 射线晶体学分析进一步确定其相互作用模式。此外，还通过表面等离子共振（SPR）技术分析蛋白间的结合亲和力。

研究结果

1. NT-108 的体内抗病毒活性：研究人员制备了 NT-108 抗体，并在叙利亚金黄地鼠模型中评估其预防和治疗效果。实验结果显示，在感染 SARS-CoV-2 前 2 小时给予 5mg/kg 或 1.25mg/kg 的 NT-108 进行预防治疗，能够有效防止地鼠体重严重下降，且 5mg/kg 剂量组的预防效果更为显著，从感染后第二天起，治疗组与未治疗组的体重差异逐渐增大，同时该组地鼠肺部的病毒基因组含量也显著降低。在感染后 24 小时给予 NT-108 进行治疗，同样能防止地鼠体重下降，虽然治疗效果相比预防治疗略有降低，但也明显减少了肺部的病毒基因组含量。这表明 NT-108 在体内具有显著的抗病毒活性。
2. NT-108 单链可变片段（scFv）的制备：为了深入了解 NT-108 识别 SARS-CoV-2 Spike 蛋白的结构基础，研究人员最初制备了 NT-108 的 Fab 片段，并与经过工程改造以稳定三聚体形式的 SARS-CoV-2 Spike 6P 进行复合。然而，由于在网格制备过程中存在强烈的偏好取向，即使采用阶段倾斜法也未能成功重建高分辨率的 3D 图谱。因此，研究人员转而制备 scFv 构建体，他们制备了两种不同取向的 scFv，即 VH - 接头 - VL（HL）和 VL - 接头 - VH（LH）。结果发现，LH 取向的 scFv 在包涵体产量和重折叠效率上略优于 HL 取向，于是选择 scFv-LH 进行后续实验。此外，研究人员还构建了哺乳动物表达载体用于表达 NT-108 scFv，并通过 SPR 分析证实，在大肠杆菌和 HEK293T 细胞中制备的 NT-108 scFv 与 RBD 具有高亲和力，其解离常数（K_D）值与 Fab 形式相当。
3. NT-108 scFv 与 Spike 三聚体复合物的 Cryo-EM 结构：研究人员成功重建了 NT-108 scFv 与 SARS-CoV-2 Spike 复合物在 1-up 和 2-up 状态下的 Cryo-EM 图谱，分辨率达到 3.28 ?。结果显示，NT-108 scFv 能够与向下（down）和向上（up）的 RBD 结合，与 NT-108 scFv 结合的 down RBD 与相邻的 up RBD 存在空间接触，这可能有效抑制了与 ACE2 的结合。进一步对 down RBD 和 NT-108 scFv 界面进行局部精修，获得了分辨率为 3.27 ? 的图谱，确定 NT-108 为 2 类抗体。通过计算 RBD 残基的埋藏表面积（BSA）发现，NT-108 的 VL 结构域比 VH 结构域更广泛地识别 RBD。此外，X 射线晶体学分析结果与 Cryo-EM 结构高度吻合，揭示了两者基本相同的相互作用模式。
4. 氨基酸突变对 NT-108 活性的影响：在基于多种 VOC 序列的 RBD 进行的 ACE2 结合抑制活性测定中，NT-108 对 Alpha 和 Delta 变异株的抑制活性与野生型武汉株（Wuhan-Hu-1）相当，但对 Beta 和 Gamma 变异株则完全失去抑制活性。在 Beta 和 Gamma 变异株共有的氨基酸突变中，E484K 位于 NT-108 的抗原表位内。通过对 RBD 进行单氨基酸突变实验发现，L452R 和 N501Y 单突变不影响 NT-108 的抑制活性，而 E484K 单突变则导致其完全丧失抑制活性。进一步研究发现，E484A 和 E484Q 突变体对 ACE2 的抑制活性优于 E484K 突变体，这表明 E484 残基是 NT-108 识别 RBD 的关键位点，主要通过形成盐桥相互作用发挥作用。对携带 E484A 和 E484K 突变的 Omicron 亚变体进行检测，发现 NT-108 对所有测试变体的 ACE2 抑制活性均完全丧失，这可能是由于 Omicron 亚变体在 NT-108 抗原表位区域的氨基酸突变高度积累和多样化所致。此外，研究人员在体外筛选出了 NT-108 的抗体逃逸突变体，鉴定出两种不同的 RBD 单突变（E484R 和 S494P），这两种突变均阻断了与 NT-108 重链的相互作用，表明重链相互作用对 NT-108 与 RBD 的强相互作用和有效抑制 ACE2 结合活性至关重要。

研究结论与意义

本研究对源自 RBD 免疫人源化小鼠的 SARS-CoV-2 中和抗体 NT-108 进行了结构表征。NT-108 在金黄地鼠模型中展现出强大的预防和治疗效果，虽然其对重症 COVID-19 的效果仍需在其他致死性感染动物模型中进一步验证，但这一发现依然具有重要意义。通过 Cryo-EM 分析 NT-108 scFv 与 SARS-CoV-2 Spike 复合物的结构，揭示了 NT-108 的结合模式，其重链和轻链能够识别 RBD 的大部分 ACE2 结合位点。研究还明确了 VOC 突变和逃逸突变对 NT-108 亲和力的影响，为理解抗体中和机制提供了重要依据。

此外，研究发现 NT-108 的 VL 结构域在识别 RBD 中发挥了重要作用，这与其他同类中和抗体中 VH 结构域占主导的模式不同，凸显了 NT-108 在抗体开发中 VH 和 VL 相互作用位点的高潜力。同时，NT-108 可能通过诱导 Spike 蛋白的预融合状态捕获来抑制膜融合，从而发挥中和活性。

综合来看，本研究对 NT-108 中和机制的结构洞察以及对氨基酸突变影响的研究，为开发具有广泛中和活性的治疗性抗体提供了宝贵的见解和策略，有助于推动新冠病毒治疗领域的进一步发展。