世卫组织疟疾核酸扩增检测外部质量评估计划：6 年 11 次分发结果揭示的关键信息

《Malaria Journal》：WHO malaria nucleic acid amplification test external quality assessment scheme: results of eleven distributions over 6 years

为确保疟疾核酸扩增检测（NAAT）数据可靠，研究人员开展相关评估，发现实验室检测性能随时间提升，该计划意义重大。

　　疟疾，一直以来都是全球健康的重大威胁，2022 年约有 60.8 万人因它失去生命，大部分死亡发生在撒哈拉以南非洲地区。准确及时地诊断疟疾对于有效控制疟原虫感染、在疟疾流行国家开展消除工作至关重要。自 2010 年起，世界卫生组织（WHO）就建议在治疗前通过基于寄生虫的诊断方法确诊疟疾。

在疟疾诊断工具中，核酸扩增检测（NAAT）近几十年来发展迅速。它能检测出极低密度的疟原虫感染，在疟疾研究、高收入国家的诊断以及向疟疾消除迈进的低传播国家中都发挥着重要作用。比如在新抗疟药物或疫苗的临床试验、药物疗效研究、新诊断方法评估以及流行病学研究中，NAAT 都不可或缺。而且，它还能用于研究疟原虫的分子标记，判断恶性疟原虫的 pfhrp2/3 基因是否缺失，以及区分混合或多克隆感染等。

不过，由于 NAAT 的检测结果常被用于制定疫苗、药物和诊断相关政策，其质量控制至关重要。然而，此前疟疾 NAAT 的外部质量评估（EQA）计划却很少见。为解决这一问题，WHO 全球疟疾规划与英国国家外部质量评估服务（UK NEQAS）寄生虫学部门于 2017 年 1 月合作推出了 WHO 疟疾 NAAT EQA 计划，旨在提高不同实验室分子数据的可靠性和可比性。该研究成果发表在《Malaria Journal》上。

研究人员为开展这项研究，采用了以下主要关键技术方法：

1. 样本制备：利用 EDTA 抗凝的外周血剩余临床样本，在 UK NHS Blood and Transplant 提供的疟原虫阴性全血中进行稀释。通过专家显微镜检查确定预稀释寄生虫密度，再用阴性全血稀释至所需密度。样本制成冻干血（LB）和干血斑（DBS）两种形式。
2. 实验室参与及数据收集：邀请全球各地区的参考和研究实验室参与，实验室需在规定时间内通过网络平台提交检测结果。
3. 数据分析：运用设计基于 F 检验评估性能差异，通过广义混合模型结合 logit 链接函数分析实验室性能随时间的变化。

下面来看看具体的研究结果：

1. 参与实验室情况：共有 75 家实验室参与，分布在 42 个国家。非洲、亚洲、欧洲、南美洲和中美洲、北美洲、澳大利亚均有参与实验室。实验室检测能力方面，所有实验室都能检测恶性疟原虫，多数能检测恶性疟原虫和间日疟原虫，而能检测诺氏疟原虫的实验室较少。
2. 检测性能：整体上，实验室对阴性样本检测表现最佳，阳性样本中恶性疟原虫最易被正确识别。样本格式和寄生虫密度对检测性能影响显著，LB 样本检测准确性高于 DBS 样本，寄生虫密度越高，检测效果越好。参考实验室在识别恶性疟原虫样本和低寄生虫密度样本方面表现更优。
3. 检测方法：最常用的核酸提取方法是硅胶柱法，最常用的扩增方法是实时单靶 PCR 和巢式 PCR，但不同方法的检测性能无显著差异。
4. 性能随时间变化：随着参与次数增加，实验室对低密度恶性疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫样本的检测能力显著提高，而对阴性样本和高密度恶性疟原虫样本的检测性能一直保持较高水平。

研究结论和讨论部分表明，该 EQA 计划有效提升了实验室的检测性能，但仍存在一些问题。例如，对极低密度感染（<2 寄生虫 /μL）和较少见疟原虫种类的检测能力有待提高。此外，尽管实验室参与数量总体增加，但每次分发参与比例变化不大，部分实验室存在参与不规律的情况。未来，该计划可进一步拓展，如检测恶性疟原虫的 pfhrp2 和 / 或 pfhrp3 基因缺失以及抗疟药物耐药标记等，以更好地应对疟疾防控的挑战。同时，资助者应要求相关实验室参与 EQA 计划，各国也应将此类计划纳入国家评估项目，从而提升实验室检测的准确性和可靠性，为疟疾监测、疾病管理和研究提供有力支持。