LRRK2 激酶失活突变小鼠中，病毒介导的 α- 突触核蛋白过表达的独特发现与意义

《Scientific Reports》：Viral mediated α-synuclein overexpression results in greater transgene levels and α-synuclein overload in mice bearing kinase dead mutation of LRRK2

为探究 LRRK2D1994S激酶失活（KD）突变小鼠对突触核蛋白病的易感性，研究发现其 α- 突触核蛋白负荷增加但无神经元退变。

　　帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的神经退行性疾病，其主要病理特征包括中脑黑质致密部（substantia nigra pars compacta，SNpc）多巴胺能神经元的缺失，以及细胞内路易小体（Lewy Bodies，LB）和路易神经突的形成，这些结构主要由丝氨酸 129（Serine129，pSer129）磷酸化的 α- 突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）组成。LRRK2 基因的突变与 PD 的发生密切相关，然而，LRRK2 突变与突触核蛋白病理之间的关系却并不明确。

在过往研究中，关于 LRRK2 突变如何影响 α-syn 的功能和代谢，存在诸多争议。例如，虽然 LRRK2 的 G2019S 突变会增强激酶活性，但转基因 G2019S 过表达小鼠和 G2019S 敲入（knock-in，KI）小鼠并不会自发形成典型的 LB 或 LB 样 α-syn 包涵体。同时，体内研究也未能明确证明 G2019S KI 小鼠存在主要的自噬溶酶体途径（autophagy-lysosomal pathway，ALP）改变。

为了深入探究这一问题，来自意大利费拉拉大学（University of Ferrara）和法国波尔多大学（Université de Bordeaux）的研究人员开展了相关研究。他们将携带人 A53T α-syn（AAV-h-A53Tα-syn）的腺相关病毒 2/9（adeno-associated virus 2/9，AAV2/9）或作为对照的 AAV2/9 - GFP 分别注射到 12 月龄的 LRRK2 KD 和野生型（wild type，WT）小鼠体内，旨在观察 α-syn 病理变化、黑质纹状体多巴胺能神经元变性以及运动行为的改变。该研究成果发表在《Scientific Reports》上。

在研究方法上，研究人员首先选取了 19 只 12 月龄的 LRRK2 KD 小鼠和 19 只年龄匹配的 WT 小鼠。对这些小鼠进行拖曳测试（drag test）训练，待其运动表现稳定后确定基线水平。随后，将小鼠随机分为四组，分别进行 AAV-h-A53Tα-syn 或 AAV-GFP 的立体定位注射。在注射后的 30 天、60 天和 90 天，再次对小鼠进行拖曳测试。实验结束后，对小鼠进行心脏灌注固定，取脑进行免疫组化分析。免疫组化实验中，研究人员使用了多种针对不同蛋白的抗体，如兔抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、兔抗 α-syn、兔抗人 α-syn 和兔抗 pSer129-α-syn 等，以检测相关蛋白的表达水平。同时，运用立体学分析方法对黑质中的 TH⁺神经元数量进行计数，并对纹状体中的 TH⁺染色强度进行光学密度分析。

研究结果显示，在运动能力方面，注射 AAV-h-A53Tα-syn 的 LRRK2 KD 小鼠在拖曳测试中的步数较注射前基线水平有所下降，而注射 AAV-h-A53Tα-syn 的 WT 小鼠则未出现这种情况。这表明 LRRK2 KD 小鼠在病毒介导的 α-syn 过表达后，运动功能受到了更明显的影响。

在转基因表达水平上，免疫组化分析发现，注射 AAV-h-A53Tα-syn 的 LRRK2 KD 小鼠中，黑质和纹状体的 h-A53Tα-syn 染色水平均显著高于 WT 小鼠。这意味着 LRRK2 激酶失活会导致更高的转基因表达，进而增加 α-syn 的负荷。

关于 α-syn 的磷酸化水平，在注射 AAV-h-A53Tα-syn 后，LRRK2 KD 小鼠黑质和纹状体中的 pSer129 α-syn 染色强度约为 WT 小鼠的两倍。这说明 LRRK2 KD 小鼠中 α-syn 的磷酸化程度更高，可能更易形成聚集。

然而，在黑质纹状体多巴胺能神经元的完整性方面，立体学分析和光学密度分析均未发现注射 AAV-h-A53Tα-syn 的小鼠与注射 AAV-GFP 的对照小鼠之间存在明显差异。这表明尽管 LRRK2 KD 小鼠中 α-syn 病理变化明显，但并未导致多巴胺能神经元的显著退变。

研究结论和讨论部分指出，LRRK2 KD 小鼠中观察到的更高的 α-syn 负荷，可能是由于病毒转导效率增加和 / 或 α-syn 清除缺陷所致，这或许与 ALP 受损有关。虽然在该研究模型中，LRRK2 激酶活性的增强或沉默均会加重 α-syn 病理变化，但可能是通过不同的机制实现的。此外，LRRK2 KD 小鼠纹状体和黑质中 α-syn 负荷的增加与轻微的运动功能下降相关，尽管此时并未出现黑质神经元的退变，这提示可能存在非多巴胺能的代偿机制参与了运动功能障碍的发生。

综上所述，该研究揭示了 LRRK2 激酶失活突变小鼠在病毒介导的 α-syn 过表达情况下的独特病理变化，为深入理解 LRRK2 与 α-syn 之间的关系以及帕金森病的发病机制提供了重要线索，有助于推动未来针对帕金森病的研究和治疗策略的发展。