miR-155 靶向 p65 调控奶牛早期妊娠子宫内膜 PD-L1 表达，为生殖难题 “解锁”

《Scientific Reports》：MicroRNA-155 targets p65 to regulate PD-L1 expression in the early pregnancy endometrium

为解决奶牛生殖障碍问题，研究人员开展 miR-155 对奶牛早期妊娠子宫内膜 PD-L1 表达的调控研究，发现其通过 p65 调控，为奶牛生殖研究提供理论依据。

　　在奶牛养殖的世界里，生殖障碍就像一块巨大的 “绊脚石”，严重阻碍着乳业的发展。在众多导致奶牛妊娠失败的因素中，胚胎流失和早期胎儿流产最为关键，多数胚胎流失发生在妊娠的前 60 天，这使得许多集约化奶牛场的人工授精产犊率低于 30%，不仅影响了奶牛的繁殖性能，还让养殖户的经济收益大打折扣。

成功的妊娠与母体子宫对胚胎的免疫耐受机制紧密相连，而 PD-1/PD-L1 信号通路在免疫调节、免疫耐受和维持妊娠方面发挥着重要作用。此外，NF-κB 信号通路也至关重要，其关键蛋白 p65 在胚胎植入、胎盘形成等过程中不可或缺。MicroRNAs（miRNAs）作为一类非编码 RNA，能对基因表达进行调控，参与多种生理和病理过程，其中 miR-155 在众多疾病和生理活动中都扮演着关键角色。

为了深入探究奶牛早期妊娠子宫内膜的奥秘，华中农业大学的研究人员开展了一系列研究。他们希望找出早期妊娠子宫内膜中差异表达的基因，并弄清楚 miR-155 通过 p65 调控 PD-L1 表达的具体机制，为解决奶牛生殖障碍问题提供理论支持。这项研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，从当地屠宰场获取奶牛子宫组织，按照黄体和子宫形态进行分类。接着，通过组织学分析和免疫组化技术，观察组织形态和相关蛋白的表达。细胞培养方面，培养了牛子宫内膜上皮细胞系（bEECs）和 HEK293T 细胞。采用细胞转染技术，将 miR-155 模拟物、抑制剂、p65 siRNA 等导入细胞。利用 RNA 分离和 qPCR 分析技术检测基因表达水平，通过 Western blot 实验检测蛋白表达，还使用荧光素酶报告基因实验验证 miR-155 与 p65 的靶向关系。

研究结果如下：

• PD-L1 在早期妊娠子宫内膜组织中表达增加：研究人员发现，早期妊娠子宫内膜上皮细胞增厚，细胞核呈圆形。免疫组化结果显示，早期妊娠组子宫内膜上皮中 p65 和 PD-L1 的表达水平显著高于非妊娠组；qPCR 和 Western blot 结果也表明，早期妊娠组中 p65、PD-L1、M-CSF 和 IL-34 的 mRNA 和蛋白表达水平均明显升高。
• E₂或 P₄刺激细胞后 PD-L1 和 p65 的表达水平变化：用 E₂和 P₄刺激 bEECs 模拟妊娠环境，qPCR 结果显示，p65、PD-L1、M-CSF 和 IL-34 的 mRNA 表达水平受刺激时间和浓度影响。在蛋白水平，E₂刺激后，p65、磷酸化 p65 和 PD-L1 蛋白表达随浓度升高而下降；P₄刺激后，这些蛋白表达随浓度升高而增加。
• E₂和 P₄共刺激细胞后 PD-L1 和 p65 的表达水平变化：E₂和 P₄共刺激 bEECs 时，p65、PD-L1、M-CSF 和 IL-34 的 mRNA 表达趋势不同。在蛋白水平，6 小时共刺激后，部分蛋白表达略有增加但不显著；12 小时共刺激后，蛋白表达随 E₂和 P₄浓度升高而增加；24 小时共刺激后，蛋白表达略有下降但不显著。
• p65 是 miR-155 的分子靶点：通过 TargetScan 预测，研究人员发现 p65 是 miR-155 的潜在靶点，其结合位点位于 p65 mRNA 的 3'-UTR。实验结果显示，早期妊娠组中 miR-155 表达显著低于非妊娠组。双荧光素酶报告基因实验表明，miR-155 模拟物能显著抑制荧光素酶活性，且 miR-155 模拟物和抑制剂分别能降低和增加 p65 蛋白表达。
• p65 调节 PD-L1 蛋白表达：利用 siRNA 敲低 p65 蛋白表达，结果显示磷酸化 p65 和 PD-L1 蛋白表达水平降低；过表达 p65 蛋白后，磷酸化 p65 和 PD-L1 蛋白表达水平升高，这表明 p65 对 PD-L1 蛋白表达有调节作用。

研究结论和讨论部分指出，在奶牛早期妊娠过程中，miR-155 通过靶向 p65 来调节 PD-L1 的表达。这一调控通路为研究妊娠免疫耐受机制提供了新的视角，也为减少奶牛临床生殖障碍提供了潜在的策略。不过，该研究未涉及 PD-L1 在妊娠免疫环境中对免疫细胞的作用，后续研究可以朝着这个方向深入探索。总的来说，这项研究为奶牛生殖领域的发展奠定了重要的理论基础，有望在未来帮助养殖户解决实际问题，推动乳业的健康发展。<