未修饰 RNA 序列形成具有潜在抗 RSV 和抗血管生成应用的异常稳定 G - 四链体

《Communications Biology》：Unmodified RNA sequences form unusual stable G-quadruplexes with potential anti-RSV and anti-angiogenesis applications

为解决核酸适体临床应用难题，研究人员开展未修饰 RNA 序列 G - 四链体（G4s）研究，其展现双重治疗潜力。

　　在生命科学的广阔领域中，核酸宛如一把神奇的钥匙，其序列能构建出独特的三维结构，精准地与各类目标分子结合，在医疗诊断和治疗领域展现出巨大的潜力，就像拥有着打开治愈各种疾病大门的魔力。然而，理想很丰满，现实却很骨感。当前，核酸在临床应用的道路上困难重重。一方面，核酸在血液中会迅速被清除，就像在战场上还没来得及发挥作用就被敌人 “消灭” 了；另一方面，其安全性也备受质疑，化学修饰虽能提高稳定性，却可能带来意想不到的毒性，这无疑是给核酸的临床应用 “泼了一盆冷水”。在这样的困境下，如何找到一种既稳定又安全的核酸结构，成为了科研人员们亟待攻克的难题。

为了解开这个难题，贵州医科大学的研究人员勇挑重担，展开了一项极具意义的研究。他们将目光聚焦于一种名为 G - 四链体（G4s）的 RNA 结构，试图探究这种结构在医疗领域的巨大潜力。最终，他们的努力取得了丰硕的成果，相关研究发表在了《Communications Biology》上。这一成果犹如一颗璀璨的星星，为核酸治疗的发展照亮了前行的道路。

在这项研究中，研究人员采用了多种关键技术方法。首先，通过合成特定的 RNA 序列，并运用圆二色谱（CD）、非变性凝胶电泳和变性凝胶电泳等技术，对 G4s 的结构和稳定性进行了深入分析。其次，利用表面等离子共振（SPR）、免疫荧光流式细胞术和激光共聚焦显微镜等实验手段，研究了 G4s 与细胞表面核仁素（NCL）的结合特性。此外，还运用蛋白质免疫印迹（Western blot）、实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）等技术，评估了 G4s 的抗 RSV 活性和抗血管生成作用。

研究结果主要分为以下几个方面：

1. 发现稳定的 G - 四链体：研究人员合成了多个含端粒重复序列的 RNA 序列，CD 光谱显示这些序列均形成了平行的 G4 结构。熔解曲线表明 ORN 1、3、4 G4s 具有高的热稳定性，在 95°C 时仍能保持较高信号。非变性凝胶电泳和变性凝胶电泳结果显示，这些序列形成了异常高阶结构，且 ORN 2、3、4 在变性条件下也能保持稳定。核酸酶稳定性实验表明，ORN 3 和 ORN 4 G4s 在含 10% 胎牛血清的细胞培养基中孵育 96 小时后，仍能保持 90% 以上的稳定性，远优于 AS1411。NMR 实验进一步证实了 ORN 3 和 ORN 4 形成了 G4 结构。
2. ORN 3、ORN 4 G4s 与细胞表面 NCL 特异性结合：SPR 实验表明，ORN 3 和 ORN 4 G4s 与 NCL 具有较强的结合能力，K_d值分别为 5.88 ± 0.25 nM 和 4.23 ± 0.12 nM，而突变序列无法形成 G4 结构且不与 NCL 结合。免疫荧光实验和激光共聚焦显微镜观察结果显示，ORN 3 和 ORN 4 G4s 能特异性结合细胞表面的 NCL，且主要结合在细胞膜上，对细胞内 NCL 调节蛋白表达的功能影响较小，MTT 实验表明其对正常细胞的细胞毒性极小。
3. ORN 3、ORN 4 G4s 的抗 RSV 活性：由于 NCL 在 RSV 感染过程中起着关键作用，研究人员探究了 ORN 3 和 ORN 4 G4s 的抗 RSV 活性。Western blot 和 RT-qPCR 实验结果显示，ORN 3 和 ORN 4 G4s 预处理 Hep-2 细胞后，RSV 的核衣壳（N）基因和融合蛋白（F 蛋白）表达均显著降低。MTT 实验表明，随着 ORN 3 和 ORN 4 G4s 浓度的增加，RSV 感染细胞的活力逐渐恢复，表明其能有效抑制 RSV 感染。
4. G4s 对 rhVEGF 刺激的 HUVECs 细胞增殖和迁移的影响：细胞表面表达的 NCL 是血管生成血管内皮细胞的标志物，研究人员检测了 ORN 3 和 ORN 4 G4s 对 rhVEGF 刺激的 HUVECs 细胞增殖和迁移的影响。结果显示，ORN 3 和 ORN 4 G4s 能显著抑制 rhVEGF 刺激的 HUVECs 细胞增殖和迁移，且呈浓度依赖性，其机制可能与下调基质金属蛋白酶 - 2（MMP-2）和基质金属蛋白酶 - 9（MMP-9）的表达有关。
5. G4s 对 rhVEGF 刺激的 HUVECs 细胞管形成的抑制作用：为进一步探究 ORN 3 和 ORN 4 G4s 的抗血管生成活性，研究人员进行了细胞管形成实验。结果显示，rhVEGF 能促进 HUVECs 细胞管形成，而 ORN 3 和 ORN 4 G4s 能抑制这一过程，且能下调 VE - 钙粘蛋白的表达，表明其具有抗血管生成作用。
6. ORN 3 和 ORN 4 G4s 的抗血管生成作用验证：研究人员利用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成模型验证了 ORN 3 和 ORN 4 G4s 的抗血管生成作用。结果显示，ORN 3 和 ORN 4 G4s 能显著抑制血管分支和发育，与阳性对照 AS1411 效果相似，进一步证实了其抗血管生成活性。

研究结论表明，未修饰 RNA 序列形成的 G4s 具有高度稳定性和极低细胞毒性，能特异性结合细胞表面 NCL，具有抗 RSV 和抗血管生成的双重潜力，为肿瘤和 RSV 感染的治疗提供了新的策略和潜在的治疗手段。在讨论部分，研究人员也指出，虽然大多数高耐热性的 ORN 与血清中的高生物稳定性相关，但仍存在像 ORN 1 这样的特殊情况，其在血清中快速被消化的原因有待进一步研究。此外，ORN 3 和 ORN 4 G4s 难以进入细胞的机制也需要更深入的探索，未来可通过纳米颗粒等递送方法提高其疗效。总的来说，这项研究为核酸治疗领域开辟了新的方向，具有重要的理论意义和临床应用价值，有望为相关疾病的治疗带来新的突破。