短环工程策略：通过刚性敏感位点挖掘提升酶热稳定性的新方法

《iScience》：Short-loop engineering strategy for enhancing enzyme thermal stability

　　

酶作为高效生物催化剂，在生物制造和合成生物学领域具有不可替代的作用。然而，热稳定性不足始终制约着工业酶的应用效能——高温环境下酶结构易解折叠，导致催化活性丧失。这一瓶颈不仅增加生产成本，更限制了高温反应场景的开发。传统策略如B因子法主要针对柔性区域进行刚性化改造，但往往忽视刚性区域中隐藏的关键稳定位点。北京化工大学生物炼制工程研究中心团队在《iScience》发表的研究，开创性地提出短环工程策略，通过系统挖掘短环区刚性"敏感残基"并实施空腔填充突变，成功实现三种工业用酶的热稳定性突破。

研究团队采用多尺度计算方法与实验验证相结合的技术路线：首先运用AlphaFold2构建高精度蛋白质模型，通过PyMOL可视化结合ParkVFinder空腔分析定位短环区敏感位点；继而采用FoldX计算未折叠自由能(△△G)进行虚拟饱和突变筛选；对候选突变体进行100 ns分子动力学模拟评估RMSF(均方根涨落)和RMSD(均方根偏差)变化；最终通过异源表达和热稳定性实验验证改造效果。研究选用乳酸脱氢酶(PpLDH)、尿酸氧化酶(UOX)和D-乳酸脱氢酶(LDHD)作为模式酶，建立包含中国典型工业菌株来源酶的验证体系。

研究结果部分，"探索短环工程中的关键位点"显示，在PpLDH的六残基短环(Asn96-Val97-Pro98-Ala99-Tyr100-Ser101)中，Ala99位点形成265 ?³空腔。虚拟饱和突变筛选发现14个△△G<0的有利突变，实验证实A99Y突变使45°C下半衰期提升至690分钟(野生型72.6分钟)，空腔体积缩减至48 ?³以下。分子动力学模拟揭示该突变未改变自身RMSF，但显著降低了123-137区域的波动性。

"短环工程的特征"部分阐明四大机制：短环区空腔存在是稳定性薄弱环节；疏水相互作用增强是主要驱动力——突变后短环区连续疏水残基(Val97-Pro98-Tyr99-Tyr100)形成更强相互作用网络；敏感残基位于刚性区域(RMSF值低于平均值)；突变通过限制邻近残基(如Arg154)的自由运动实现全局稳定。FoldX计算显示A99Y的△△G达-1.83 kcal/mol，证实能量有利。

在"应用短环工程提升UOX热稳定性"中，研究人员在Asn72-Pro77短环中发现Thr75空腔位点。T75W突变使40°C下半衰期提升3.11倍，分子模拟显示该突变通过填充150 ?³空腔并形成π-阳离子相互作用实现稳定。类似地，"LDHD热稳定性改造"部分显示，七残基短环(Leu184-Asp190)中的Glu187位点突变E187F使60°C下半衰期提升43%，关键机制是通过限制Lys164的波动增强121-140区域刚性。

讨论部分指出，该研究建立的标准化流程包含三个关键步骤：高精度建模→可视化空腔分析→虚拟能量筛选。开发的PyMOL插件可实现敏感残基的可视化快速定位。与传统B因子策略相比，短环工程具有三大优势：能挖掘刚性区隐藏的敏感位点；通过填充空腔产生"结构约束"效应；突变影响具有跨结构域传递特性。研究同时指出局限性：目前尚缺乏直接观测空腔填充后动态变化的实验手段。

这项研究的重要意义在于：理论上，揭示了短环区刚性敏感残基在维持蛋白质整体构象中的枢纽作用；方法学上，建立了可推广的短环工程标准化流程和计算工具；应用层面，为工业酶热稳定性改造提供了新范式。三种模式酶的成功改造案例证明该策略具有广泛适用性，未来可拓展至更多生物催化剂的设计优化，对降低生物制造能耗、开发高温生物工艺具有重要价值。