利用全长感染性克隆反向遗传系统构建人工减毒禽腺病毒 4 型病毒载体

《Veterinary Research》：Generation of an artificially attenuated fowl adenovirus 4 viral vector using the reverse genetics system based on full-length infectious clone

为构建禽腺病毒 4 型（FAdV-4）反向遗传系统，研究人员构建其感染性克隆，成功减毒，为疫苗开发提供新途径。

　　# 禽腺病毒 4 型研究：开启疫苗开发新征程
在禽养殖业中，高致病性禽腺病毒 4 型（FAdV-4）可谓是个 “大麻烦”。它是引发肝炎和心包积水综合征的罪魁祸首，自 2015 年起在中国广泛传播，给家禽养殖带来了巨大的经济损失。

FAdV-4 是一种无包膜双链 DNA 病毒，其基因组长度为 43 - 45kb。这一特点本让它成为开发多价或多系列疫苗的潜力 “选手”，可在实际操作中却困难重重。以往对 FAdV-4 基因组 DNA 进行体外操作时，由于可用的限制性酶有限，PCR 技术也难以扩增如此长的序列，使得研究进展缓慢。即便通过在真核细胞中进行同源重组来改造病毒基因组，效率也很低，获得重组病毒更是难上加难。

为了解决这些问题，南京农业大学的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们的目标是构建一个易于使用的 FAdV-4 反向遗传系统，以便更好地研究 FAdV-4 的基因组功能，并将其开发成一种病毒载体。最终，他们成功构建了含有 FAdV-4 全长基因组 DNA 的感染性克隆，并建立了有效的反向遗传系统。这一成果为 FAdV-4 作为潜在病毒载体的开发开辟了新的道路，相关研究发表在《Veterinary Research》上。

在研究过程中，研究人员用到了多个关键技术。首先是 lambda Red 介导的重组技术，利用该技术在大肠杆菌 DH10B 中构建 FAdV-4 的感染性克隆。其次是 rpsL 反选择系统，借助它对 FAdV-4 基因组进行精确编辑。此外，通过病毒拯救实验，验证了感染性克隆的有效性；利用动物实验，评估重组病毒的致病性。

构建 FAdV-4 感染性克隆

研究人员先构建了一个中间质粒，其源于质粒 pACYC177。他们扩增了 pACYC177 的骨干、FAdV-4 的 5’端片段和 3’端片段，然后将这三个 PCR 产物在体外组装并转入 DH10B 中。经过氨苄青霉素筛选和基因特异性扩增，鉴定出阳性克隆。接着，用 Hind III 消化中间质粒 pHR4K，使其产生 FAdV-4 基因组 DNA 的同源臂。将线性化的 pHR4K 和纯化的 FAdV-4 基因组 DNA 共电穿孔到含有 pRedET 的 DH10B 感受态细胞中，成功构建了 FAdV-4 的感染性克隆。经鉴定，构建的 5 个 FAdV-4 感染性克隆序列高度一致，与参考序列的一致性达 99.36%，彼此间一致性为 99.97%。

病毒拯救及生长动力学研究

为验证能否从感染性克隆中拯救出有活力的 FAdV-4 病毒，研究人员用 Pac I 消化 2μg 经序列确认的感染性克隆 pFAdV4，然后将其转染到 LMH 细胞中。结果发现，转染野生型 FAdV-4（wtFAdV-4）基因组 DNA 和 pFAdV4 基因组 DNA 的 LMH 细胞在 120 小时后都出现了细胞病变效应（CPE），而空白细胞和仅加脂质体试剂的细胞未出现 CPE。拯救出的病毒 rFAdV-4 经过 5 次传代后，对其与 wtFAdV-4 的生长动力学进行测试，发现两者在各时间点的生长曲线无显著差异（P>0.05），在 72 小时时病毒滴度均达到 10^7.8 PFU/mL。

构建重组感染性克隆 pON1 Hexon

研究人员采用两轮 lambda Red 介导的重组方法，试图用 ON1 六邻体（Hexon）序列替换 FAdV-4 的六邻体序列来构建重组感染性克隆。起初，由于重组过程中遇到问题，未能成功构建所需质粒。后来，他们将 pFAdV4 的骨干替换为 pBeloBac11 的 MiniF - CmR，解决了问题，成功构建了重组感染性克隆 pON1，其中六邻体编码序列被 ON1 的六邻体序列成功替换。

ON1 六邻体替换对 FAdV-4 致病性的影响

为研究重组病毒 rON1 的致病性，研究人员用 rON1 对 21 日龄的鸡进行接种实验。结果显示，接种 wtFAdV-4 和 rFAdV-4 的鸡在接种 1 天后出现精神萎靡、扎堆、羽毛蓬松等症状，2 天后死亡，wtFAdV-4 组死亡 9 只，rFAdV-4 组全部死亡。而接种 rON1 和对照组的鸡未出现临床症状。解剖发现，wtFAdV-4 和 rFAdV-4 组死亡鸡的心包中有大量透明淡黄色液体，肝脏发黄、脾脏充血、肾脏肿大。组织病理学分析表明，wtFAdV-4 和 rFAdV-4 组的鸡肝细胞大量坏死、肝索消失，脾脏淋巴细胞严重减少，肾小管上皮细胞受损。rON1 组的鸡脾脏淋巴细胞稍有减少，肾脏有轻度间质出血，但大体解剖未发现明显器官损伤。这些结果表明，用 ON1 的六邻体基因替换高致病性 FAdV-4 的六邻体基因后，FAdV-4 的致病性显著降低。

综上所述，研究人员成功建立了基于感染性克隆的 FAdV-4 反向遗传系统。该系统使得 FAdV-4 基因组 DNA 在细菌中可利用 lambda Red 介导的重组和 rpsL 反选择系统轻松操作。这一成果为 FAdV-4 作为潜在病毒载体的开发奠定了基础，有望推动禽多价 / 多系列疫苗的研发进程。不过，人工减毒的 FAdV-4 在肝脏、脾脏和肾脏中仍存在轻微的组织病理学变化，其安全性还需进一步研究评估，才能真正应用于家禽疫苗领域。