重组高密度脂蛋白靶向递送雷公藤红素对抗早期动脉粥样硬化研究成果显著

《Journal of Nanobiotechnology》：Recombinant high-density lipoprotein targeted delivery of celastrol to promote foam cells lipophagy against early atherosclerosis

为解决雷公藤红素（CEL）临床应用问题，研究人员开展 CEL-rHDL 靶向递送研究，发现其可抗早期动脉粥样硬化。

　　动脉粥样硬化作为心血管疾病的主要潜在因素，严重威胁着全球人类的健康。在动脉粥样硬化的发展过程中，巨噬细胞来源的泡沫细胞内大量胆固醇沉积，这在疾病的发生和发展中起着关键作用。雷公藤红素（CEL）虽具有调节脂质代谢的强大能力，但它的生物利用度低且存在潜在毒性，这大大限制了其临床应用。为了克服这些问题，北京中医药大学等机构的研究人员开展了一项研究，致力于设计一种负载 CEL 的重组高密度脂蛋白（rHDL）递送平台，期望实现对泡沫细胞的主动靶向，有效促进脂质降解，并及时将多余胆固醇逆向转运至肝脏进行代谢。该研究成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》上。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在构建和表征方面，通过薄膜分散法制备了 CEL-rHDL，并利用动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）等技术对其进行了全面表征。在细胞实验中，采用细胞活力分析、细胞摄取实验、脂质测定、自噬通量分析等方法，深入探究了 CEL-rHDL 对泡沫细胞的作用。在机制研究上，运用 RNA 测序（RNA-seq）、定量实时聚合酶链反应（qPCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）等技术，揭示了相关分子机制。此外，还建立了动脉粥样硬化小鼠模型，进行体内分布、生化血清分析、病变检测等实验，评估 CEL-rHDL 的体内疗效和安全性。

研究结果如下：

1. CEL-rHDL 的表征：制备的 CEL-rHDL 呈球形，粒径均匀，其平均粒径为 132.83±0.72nm，zeta 电位为 - 47.8±0.78mV，包封率（EE%）为 81.53±1.26%，载药率（DL%）为 3.02±0.01%。在体外药物释放实验中，在酸性（pH5.5）环境下，CEL-rHDL 释放 CEL 的比例更高，达 61.67±2.08%，这一特性有助于在动脉粥样硬化病变的酸性微环境中增强药物释放。血清稳定性实验表明，CEL-rHDL 在胎牛血清（FBS）中孵育 24h 后，粒径和 zeta 电位变化均不显著，具有良好的稳定性。溶血实验显示，CEL-rHDL 在不同浓度下溶血率均低于 5%，具有较好的血液相容性。
2. CEL-rHDL 对泡沫细胞脂质积累的影响：研究发现，ox-LDL 浓度不低于 80μg/mL 时，RAW264.7 细胞内 CE 含量超过 50%，成功诱导形成泡沫细胞。在此基础上，以 0.8μM 的 CEL 和 CEL-rHDL 处理泡沫细胞，结果表明 CEL-rHDL 降低脂质积累的效果优于 CEL，处理后泡沫细胞内 CE 含量从 54.41% 分别降至 40.76% 和 30.81%。
3. CEL-rHDL 的靶向性：利用疏水荧光染料 C6 标记，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察发现，CEL-rHDL 表面的 D4F 可特异性识别泡沫细胞表面的 SR-BI 受体，使其在泡沫细胞中的摄取效率显著高于未修饰的 CEL-NLC。并且，过量游离 D4F 预处理可竞争性消耗 SR-BI，显著减弱 CEL-rHDL 的摄取，进一步证实了其靶向性。
4. CEL-rHDL 对泡沫细胞自噬通量的影响：通过转染 mCherry-GFP-LC3B 腺病毒，观察自噬通量变化。结果显示，与对照组相比，CEL 和 CEL-rHDL 处理组的 GFP/RFP 比值降低，表明自噬通量增加，且 CEL-rHDL 组效果更明显。使用自噬抑制剂 3-MA 和 Baf 处理后，泡沫细胞内脂质积累增加，自噬相关蛋白表达改变，说明 CEL-rHDL 促进脂质降解的作用是通过诱导脂 ophagy 实现的。
5. CEL-rHDL 的作用机制：RNA-seq 分析表明，CEL-rHDL 处理的泡沫细胞与对照组相比，有 5143 个差异表达基因（DEGs），主要涉及代谢过程、细胞周期、mTOR 信号通路等。qPCR 和 Western blot 结果显示，CEL-rHDL 可激活 Ca²⁺/CaMKKβ/AMPK/mTOR 信号通路，上调 CaMKKβ、AMPK 和 LC3B 的表达，下调 mTOR 和 P62 的表达，从而诱导脂 ophagy，促进脂质降解。进一步研究发现，CEL-rHDL 通过抑制内质网 / 肌浆网 Ca²⁺ ATP 酶（SERCA），使细胞质 Ca²⁺浓度升高，进而激活 CaMKKβ，最终诱导脂 ophagy。
6. CEL-rHDL 对胆固醇流出的影响：采用 NBD - 胆固醇标记实验，发现 CEL-rHDL 和 rHDL 均能显著促进泡沫细胞的胆固醇流出，且效果优于 CEL，这有助于减少泡沫细胞内的脂质负担。
7. CEL-rHDL 的体内疗效和安全性：在动脉粥样硬化小鼠模型中，注射 CEL-rHDL/DiR 后，主动脉树的荧光强度显著高于 CEL-NLC/DiR 组，表明 CEL-rHDL 具有良好的体内靶向性。治疗 4 周后，CEL-rHDL 降低了血液中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平，升高了高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平，显著减少了主动脉和主动脉根部的粥样硬化斑块面积。同时，CEL-rHDL 对主要器官的毒性较低，安全性良好。

研究结论和讨论部分指出，研究成功开发了一种负载 CEL 的 rHDL 纳米颗粒，能够将 CEL 靶向递送至动脉粥样硬化病变部位，且无明显全身毒性。其作用机制是通过调节 Ca²⁺/CaMKKβ/AMPK/mTOR 信号通路诱导脂 ophagy，抑制泡沫细胞脂质储存，同时 rHDL 作为游离胆固醇（FC）受体，将脂 ophagy 产生的 FC 逆向转运至肝脏进行代谢。该研究为动脉粥样硬化的治疗提供了新的思路，将基于 CEL 的降血脂作用与 rHDL 载体相结合，有望成为治疗早期动脉粥样硬化的精准策略。不过，为实现进一步的临床转化和工业应用，在保证效率的前提下，还需简化合成过程，降低制备成本。