调整内溶素 C 末端螺旋表面电荷，增强其对革兰氏阴性菌的抗菌活性

《Journal of Biomedical Science》：Surface charge of the C-terminal helix is crucial for antibacterial activity of endolysin against Gram-negative bacteria

为解决抗生素耐药问题，研究人员探究内溶素 C 末端螺旋表面电荷对其抗革兰氏阴性菌活性影响，发现调整该电荷可增强活性。

　　在医疗领域，抗生素的出现曾大幅降低致命细菌感染的发生率。然而，随着时间推移，抗生素的滥用导致了 “超级细菌” 的出现，这些细菌对多种抗生素产生了耐药性。世界卫生组织（WHO）报告显示，由 “超级细菌” 导致的死亡人数已超 35000 人，其中大部分是革兰氏阴性菌。这些细菌引发的严重感染，如败血症等，给医疗带来了极大挑战，开发抗生素替代品迫在眉睫。

在此背景下，首尔国立大学的研究人员开展了一项研究，该研究成果发表在《Journal of Biomedical Science》上。研究聚焦于内溶素（endolysin），这是一种由噬菌体在复制周期末期产生的酶，它能特异性地降解细菌细胞壁，从而促进子代噬菌体从宿主细菌细胞中释放。内溶素对革兰氏阳性菌具有强大的抗菌活性，因为革兰氏阳性菌的肽聚糖层暴露在外。但对于革兰氏阴性菌，由于其肽聚糖层被外膜（outer membrane）保护，内溶素的抗菌效果受限。

研究人员发现，一些内溶素在 C 末端具有两亲性螺旋（amphipathic helices），这有助于它们与细菌外膜的脂质成分相互作用，从而穿透外膜发挥抗菌作用。为了深入了解 C 末端两亲性螺旋的功能，研究人员以两种内溶素 LysTS3 和 LysTS6 为研究对象，它们在序列和结构上相似，都含有 C 末端两亲性螺旋。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，运用序列比对分析软件 CLC Main workbench 7 进行序列分析，通过亲和层析纯化带有 His 标签的内溶素。利用定点突变技术对 LysTS3 进行改造，构建各种突变体。采用浊度降低法分析内溶素对革兰氏阴性菌的溶菌活性，通过活菌计数法评估其抗菌活性。还借助扫描电子显微镜观察细菌细胞膜的损伤情况，运用 N - 苯基 - 1 - 萘胺（NPN）摄取试验和 SYTOX 绿色核酸染色试验检测细胞膜的通透性。

研究结果如下：

1. LysTS3 和 LysTS6 的鉴定与表达：研究人员从噬菌体 TS3 和 TS6 的基因组中鉴定出 LysTS3 和 LysTS6，它们分别由 162 和 160 个氨基酸残基组成。通过 PCR 扩增、酶切和连接，将它们的基因导入 pET - 28α 载体，并在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中成功表达和纯化。
2. LysTS3 和 LysTS6 对革兰氏阴性菌的抗菌活性差异：尽管 LysTS3 和 LysTS6 对膜透化的大肠杆菌具有相似的溶菌活性，但 LysTS6 对未透化的革兰氏阴性菌的抗菌活性明显高于 LysTS3。例如，在处理大肠杆菌 1 小时后，浓度高于 0.1μM 时，LysTS6 的抗菌活性显著高于 LysTS3；1μM 的 LysTS6 在 30 分钟内就能使大肠杆菌数量降至检测不到的水平，而相同浓度的 LysTS3 在 2 小时后才使大肠杆菌数量降低 4.1 个对数。
3. C 末端两亲性螺旋对 LysTS3 和 LysTS6 抗菌活性差异的影响：研究人员通过构建嵌合内溶素发现，LysTS3 和 LysTS6 的 C 末端 α₂螺旋在决定它们对革兰氏阴性菌的抗菌活性差异中起着关键作用。进一步分析发现，LysTS6 的 C 末端 α₂螺旋表面电荷比 LysTS3 更具正电性。
4. C 末端两亲性螺旋表面电荷对 LysTS3 抗菌活性的影响：对 LysTS3 进行定点突变，将 156 位的丙氨酸（Ala）替换为赖氨酸（Lys），160 位的谷氨酸（Glu）替换为丙氨酸，构建了 A156K、E160A 和 A156K/E160A 突变体。实验结果表明，这些突变体的抗菌活性均显著高于 LysTS3，且双突变体 A156K/E160A 的抗菌活性与 LysTS6 相当。同时，膜通透性试验显示，表面电荷更具正电性的 LysTS6 和 A156K/E160A 能使大肠杆菌外膜对内溶素更具通透性，进而导致更高的抗菌活性。
5. 其他内溶素 C 末端两亲性螺旋表面电荷的修饰效果：研究人员还对 LysSPN1S 和 LysJEP4 进行研究，通过定点突变增加其 C 末端两亲性螺旋表面的正电荷，构建了 LysSPN1Sm 和 LysJEP4m 突变体。结果发现，这些突变体在保留大部分野生型溶菌活性的同时，对革兰氏阴性菌的抗菌活性显著增强。

研究结论和讨论部分指出，本研究揭示了内溶素 C 末端两亲性螺旋表面电荷在其抗革兰氏阴性菌活性中的关键作用。通过调整表面电荷，可以显著增强内溶素对革兰氏阴性菌的抗菌活性。这一发现为内溶素的工程改造提供了新的策略，有望开发出更有效的抗菌剂来对抗革兰氏阴性菌感染。尽管研究不能完全排除其他因素对内溶素抗菌活性的影响，但该研究为理解内溶素的作用机制和优化其抗菌性能提供了重要依据，对未来内溶素在医疗领域的应用具有重要意义。