《EvoDevo》：Functional evidence supports the potential role of Tbx4-HLEA in the hindlimb degeneration of cetaceans
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研究人员为探究鲸类肢体变化机制，构建敲入小鼠模型，发现 Tbx4-HLEA 或与鲸类后肢退化有关。
在广袤的海洋中，鲸类自在遨游，它们的身体结构与陆地哺乳动物大相径庭。为了更好地适应水生环境，鲸类经历了漫长的进化历程，其中后肢退化和前肢演变成鳍状肢是显著特征。然而，这一变化背后的分子机制却一直是个谜。尽管科学家们对脊椎动物肢体发育的分子机制在模式物种（如小鼠和鸡）中有了较为深入的了解，但鲸类后肢退化的相关分子进化机制仍知之甚少。
为了揭开这一谜团，南京师范大学江苏省长江中下游生物多样性保护与利用重点实验室等机构的研究人员开展了一项重要研究，相关成果发表在《EvoDevo》上。
研究人员运用了多种关键技术方法。在构建敲入小鼠模型时，借助 CRISPR/Cas9 技术将鲸类的 Tbx4 后肢增强子 A（Tbx4-HLEA）敲入小鼠基因组。通过对不同发育阶段小鼠胚胎的研究，运用 RNA 测序（RNA-seq）分析基因表达变化，利用切割标签法（CUT&Tag）进行表观遗传分析，从而深入探究 Tbx4-HLEA 在体内对肢体发育的影响。
研究结果如下：
- 构建鲸类 Tbx4-HLEA 敲入小鼠模型：设计含有 1.1kb 鲸类 HLEA 序列的同源重组载体，将其注入小鼠受精卵，成功获得敲入小鼠。通过 PCR 和测序鉴定出纯合敲入小鼠，CUT&Tag 实验证实鲸类 HLEA 在小鼠中具有增强子活性，且其增强子活性在小鼠和鲸类之间不存在物种特异性。
- 鲸类 HLEA 纯合小鼠在 E10.5 时后肢芽发育延迟：对 E10.5-E12.5 的小鼠胚胎后肢芽进行测量分析，发现 E10.5 时纯合敲入小鼠（HKM）的后肢芽显著小于野生型（WT）小鼠；但从 E11.5 开始，HKM 与 WT 小鼠的后肢芽无明显差异，且在后续发育阶段（E18.5 和 P1），HKM 与 WT 小鼠在骨骼发育等方面也无显著差异。
- 鲸类 HLEA 调节下游基因表达导致 E10.5 时后肢芽发育延迟：RNA-seq 分析显示，E10.5 时 HKM 与 WT 小鼠的差异表达基因（DEGs）数量远多于 E11.5 和 E12.5。E10.5 时的 DEGs 包含许多调节肢体发育的关键基因，如 Hoxd13、Hoxa13 等，基因本体（GO）富集分析表明这些基因与肢体发育的生物学过程显著相关，KEGG 分析显示它们在多条信号通路中富集。RT-PCR 进一步验证了部分基因的表达变化，这表明鲸类 HLEA 可能通过调节下游基因表达导致 E10.5 时后肢芽发育延迟。
- E11.5 时 HKM 中 Tbx4 附近潜在激活增强子的功能冗余拯救其表达：表观遗传分析发现，E11.5 时 HKM 中 Tbx4 附近由 H3K27ac 和 H3K4me1 共标记的非编码元件数量增加，H3K27ac 水平显著升高，这表明 Tbx4 附近的潜在增强子处于更活跃状态。RNA-seq 和 RT-PCR 结果显示，E11.5 时 Tbx4 表达上调，且激活的非编码元件和潜在增强子主要作用于 Tbx4，使其表达恢复正常。
研究结论和讨论部分指出，该研究构建敲入小鼠模型，为鲸类 HLEA 在体内调节肢体发育提供了证据。RNA-seq 和 CUT&Tag 分析表明，鲸类 HLEA 的序列进化可能是驱动鲸类后肢退化的潜在分子机制。增强子的功能冗余在 E11.5 后拯救了敲入小鼠后肢发育延迟的现象，这揭示了生物体调节组织和器官发育的机制复杂多样。在进化过程中，鲸类可能失去了与肢体发育相关的增强子功能冗余，从而导致肢体形态改变，更好地适应水生环境。然而，鲸类后肢退化的主要原因可能并非单一因素，其他机制如增强子的被动衰减等也可能发挥作用，未来还需进一步研究。这项研究为深入理解鲸类肢体进化的分子机制提供了重要线索，也为相关领域的研究开辟了新的方向。
