甘露醇预处理诱导小麦小孢子胚胎发生与激素平衡变化及调节剂的作用

《BMC Plant Biology》：Induction of microspore embryogenesis in bread wheat by mannitol pre-treatment is associated with the disruption of endogenous hormone balance and substantial accumulation of auxins

为提升小麦小孢子胚胎发生（ME）效率，研究人员监测相关激素水平，发现甘露醇影响激素平衡，噻二唑 uron（TDZ）或可改善。

　　在植物的神奇世界里，小孢子本应按部就班地发育成花粉粒，为植物的繁衍贡献力量。然而，在实验室中，当小孢子受到特殊的处理，比如经历低温、饥饿等压力时，它们却能开启一段截然不同的旅程 —— 小孢子胚胎发生（Microspore embryogenesis，ME）。通过这个过程，小孢子能够发育成单倍体植株，再经过染色体加倍，就能得到双单倍体（Doubled haploid，DH）植株。这些 DH 植株在植物育种领域意义非凡，它们可以大大加快育种进程，降低新品种开发的成本，同时在遗传研究、生物工程等方面也发挥着重要作用。

在众多重要的农作物中，小麦占据着举足轻重的地位。但目前，小麦小孢子胚胎发生的效率却不尽如人意。这主要是因为 ME 的效率受到供体植物基因型和环境生长条件的强烈影响，导致难以找到一种通用的高效诱导方法。对于许多具有高育种价值的小麦基因型，尤其是冬小麦，研究人员一直致力于寻找提高 ME 效率的有效途径。

在此背景下，来自波兰科学院植物生理学研究所、捷克科学院实验植物研究所等机构的研究人员开展了相关研究，其成果发表在《BMC Plant Biology》上。

研究人员在实验过程中采用了多种技术方法。首先，他们选取了两个波兰冬小麦 F1 代杂交系（K393 和 PO19）以及春小麦品种 Pavon 作为实验材料。在小孢子发育到单核中期时，对分蘖进行预处理，包括低温（4°C）处理 21 - 28 天，其中最后 3 天添加 50 μmol/L 的硒酸钠（Na₂SeO₄），接着用 0.7 mol/L 的甘露醇在 20°C 黑暗条件下处理 4 天。之后，对预处理后的分蘖进行花药培养和小孢子分离培养。在培养过程中，研究人员通过 DAPI 染色确定小孢子的发育阶段，利用 FDA 染色评估小孢子的活力。同时，他们还采用了超高效液相色谱 - 串联质谱技术对植物激素进行定量分析，以此来监测在 ME 诱导过程中生长素、细胞分裂素和脱落酸（ABA）含量的变化。

在研究结果方面，研究人员发现，在 ME 诱导过程的各个步骤中，不同处理对小麦花药中激素水平的影响各不相同。低温处理对生长素含量影响较小，但改变了生长素的组成比例；硒酸钠处理对生长素和细胞分裂素的影响相对较小；而甘露醇处理则对植物激素及其内稳态产生了最为显著的影响。甘露醇处理后，所有生长素形式的含量都显著增加，尤其是氧化形式的 IAA（oxIAA），其在总生长素池中的占比大幅提高。同时，大多数细胞分裂素的水平下降，而 ABA 含量在不同品种中的变化有所差异，在 Pavon 品种中变化较为明显。

通过对不同处理下小麦花药激素内稳态的分析，研究人员发现，低温处理会引起一些基因型特异性的激素内稳态变化，而硒酸钠处理在一定程度上恢复了激素平衡。甘露醇处理则导致生长素大量积累，同时活性细胞分裂素含量大幅下降，使得 IAA/CK_A（活性生长素 / 活性细胞分裂素）和 IAA/ABA（生长素 / 脱落酸）的比值显著增加。

在 ME 诱导的效果方面，不同小麦品种之间存在显著差异。在标准诱导培养基上，Pavon 品种的花药培养和小孢子分离培养中，ME 诱导的效果明显优于 K393 和 PO19 品种。许多潜在的胚胎发生小孢子在体外培养初期就出现了各种异常，如细胞核分裂异常、淀粉粒积累、液泡破碎等，这些异常导致了胚胎发育的停滞和死亡。

为了改善 ME 诱导的效果，研究人员对诱导培养基的激素组成进行了调整。他们发现，与标准的 KBP 培养基（含有 0.9 mg/L 的 6 - 苄基腺嘌呤（BAP））相比，添加不同激素的改良培养基都能提高 ME 诱导的效果。其中，在 Pavon 品种的小孢子分离培养中，添加 1 mg/L 的毒莠定（Picloram）的 KBP 培养基诱导产生的胚胎样结构（ELS）数量最多；而添加 2 mg/L 的噻二唑 uron（TDZ）的 KBP 培养基在促进植物再生方面效果最佳。在 K393 品种中，添加 1 mg/L TDZ 和 0.5 mg/L 反式玉米素（tZ）的培养基对植物再生最为有效。

综合研究结果和讨论，研究人员得出结论：冬小麦小孢子培养中 ME 诱导效率低的原因之一是缺乏 ABA 驱动的应激防御反应。小孢子在经历甘露醇诱导的激素冲击后，又要进行机械分离和体外培养，这使得它们承受了高强度的压力。低细胞分裂素水平和失衡的生长素 / 细胞分裂素比例可能是导致小孢子体外发育过程中出现形态异常，进而使胚胎结构发育流产的重要因素。而调整诱导培养基的激素组成，如添加 TDZ，可能是解决这一问题的潜在方法，但还需要进一步研究和完善培养基的组成，以全面解决小麦小孢子胚胎发生过程中存在的问题。

这项研究为提高小麦小孢子胚胎发生效率提供了重要的理论依据和实践指导，有助于推动小麦育种技术的发展，对农业生产具有重要的意义。