肾毒性物质和氧化剂对 hiPSC 衍生肾小管细胞的影响：揭示肾脏再生关键机制

《Archives of Toxicology》：Impact of nephrotoxins and oxidants on survival and transport function of hiPSC-derived renal proximal tubular cells

为探究肾小管上皮细胞再生后功能降低原因，研究人员用 hiPSC 模型研究肾毒素和氧化剂对其分化的影响，发现分化细胞敏感性高，或影响再生。

　　在人体的排泄系统中，肾脏占据着至关重要的地位，它就像一个勤劳的 “过滤器”，不断地清除体内的药物和其他化学物质，维持着身体的内环境稳定。然而，这个 “过滤器” 也面临着诸多挑战。肾脏中的近端肾小管上皮细胞（PTEC）由于承担着肾小球滤液浓缩、转运和代谢等重要任务，极易受到有毒物质和其代谢产物的攻击，从而引发急性肾损伤（AKI）。尽管肾脏有着一定的再生能力，在损伤后会通过局部干细胞群体或存活 PTEC 的去分化来实现肾小管的再生，但这一过程并不完美。临床上发现，部分 AKI 患者即便恢复后，肾脏功能仍然存在问题，发展成慢性肾脏病（CKD）甚至终末期肾病（ESRD）的风险也大大增加。这背后的原因一直困扰着科研人员，究竟是什么导致了再生后的肾小管上皮细胞功能无法完全恢复呢？

为了揭开这个谜团，德国海因里希?海涅大学杜塞尔多夫医学院的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Archives of Toxicology》杂志上。

研究人员采用了人类诱导多能干细胞（hiPSC）模型来模拟肾脏再生过程。在实验过程中，他们使用了多种关键技术方法。首先，通过特定的培养和分化程序，将 hiPSC 诱导分化为近端肾小管上皮样细胞（PTELC）。然后，运用细胞活力检测（如 Alamar Blue Assay）、基因表达分析（RT-PCR 技术）、细胞增殖、凋亡和功能检测（EdU-Click 488 assay、TUNEL assay、流式细胞术检测白蛋白摄取）等多种实验手段，来研究肾毒素（顺铂 CisPt、环孢菌素 A CycA）和氧化剂（甲萘醌 Mena、叔丁基对苯二酚 tBHQ）对不同分化阶段细胞的影响。

研究结果表明：

1. hiPSC 衍生的肾小管祖细胞对氧化应激特别敏感：研究人员用两种氧化剂 Mena 和 tBHQ 处理不同分化阶段的细胞（hiPSC、分化第 3 天的细胞 diffD3、分化第 9 天的细胞 diffD9）24 小时后发现，diffD3 细胞对这两种氧化剂最为敏感。Mena 处理时，diffD3 的 IC₅₀约为 hiPSC 和 diffD9 的四分之一；tBHQ 处理时，diffD3 的 IC₅₀比 hiPSC 和 diffD9 低 7 - 12 倍。这表明在细胞分化过程中，分化为 PTELC 的细胞对氧化应激的敏感性显著增加。
2. 分化对细胞抗氧化防御的影响：对 diffD3 细胞敏感性的进一步研究发现，与 hiPSC 相比，diffD3 细胞中多个抗氧化防御基因的表达下调。在检测的 7 个基因中，有 5 个在 diffD3 中的表达低于 diffD9；在检测的 14 个抗氧化防御基因中，8 个在 diffD3 中显著降低，只有 p47 和 Nrf2 上调。此外，diffD9 的抗氧化能力（还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比值）显著高于 hiPSC，而 diffD3 的结果因差异较大无显著性。这解释了为什么 diffD3 细胞对氧化剂更敏感。
3. 氧化剂对近端肾小管上皮样细胞基因表达和转运的影响：研究人员分析了氧化剂对分化后 PTELC 的影响。Mena 处理 diffD9 细胞后，AQP-1、Meg 等基因的 mRNA 表达显著下降，而 CD13、Pept-1 基因表达增加；tBHQ 处理后，AQP-1 表达下降，Cad-16、Meg、Pept-1 表达上升。在白蛋白摄取功能方面，Mena 处理后白蛋白转运显著下降，tBHQ 处理后则增加。
4. 肾毒素和氧化剂对细胞分化阶段命运的影响：研究发现，CisPt 抑制 hiPSC 的增殖，但对 diffD3 和 diffD9 细胞增殖无显著影响；CycA 抑制 hiPSC 和 diffD9 细胞增殖，对 diffD3 细胞增殖影响不明显。在凋亡方面，CisPt 和 CycA 均可诱导各分化阶段细胞凋亡，且 CisPt 诱导凋亡的作用更强；Mena 和 tBHQ 仅在 diffD3 细胞中显著诱导凋亡。在衰老方面，CycA 刺激 hiPSC 中衰老相关基因表达，在 diffD9 中也有部分基因增加，但在 diffD3 中不明显；Mena 和 tBHQ 仅在 diffD9 和 diffD3 中分别使 IL-8 水平显著增加。
5. 肾毒素和氧化剂处理对分化后细胞标记表达和功能的影响：研究人员在 diffD3 阶段用肾毒素和氧化剂处理细胞，在 diffD9 阶段检测发现，所有物质都对细胞产生了长期显著影响。CisPt 导致的变化最为广泛，几乎所有转录本都显著降低，包括多能干细胞标记物 Oct 3/4 和 Nanog；CycA、Mena 和 tBHQ 也对部分基因表达产生影响。在白蛋白摄取功能上，CisPt 和 CycA 显著降低了 diffD9 细胞摄取白蛋白的能力，Mena 对白蛋白摄取相关蛋白表达有影响但对摄取功能无影响，tBHQ 对二者均无明显影响。

研究结论和讨论部分指出，本研究首次全面地揭示了肾毒素（CisPt 和 CycA）和氧化剂（Mena 和 tBHQ）对肾小管分化过程的影响。研究发现，分化过程中的细胞对这些物质高度敏感，这可能导致细胞凋亡或早期衰老，进而对肾小管再生过程产生不利影响。这一研究成果为理解肾脏再生过程中肾小管上皮细胞功能受损的机制提供了重要线索，也为开发预防和治疗肾脏疾病的新策略奠定了基础。未来，还需要进一步研究这些物质影响肾小管再生的具体分子机制，以及寻找能够减轻其负面影响的方法，为改善肾脏疾病患者的预后带来新的希望。