线粒体解聚酶 CLPB 对线粒体钙信号和动态的关键作用：开启疾病机制新认知

为探究 CLPB 对线粒体功能的影响，研究人员开展了线粒体钙信号传导和融合动力学与 CLPB 关系的研究。结果发现，CLPB 缺失会改变线粒体钙单向转运体（mtCU）组成，抑制线粒体融合，患者来源细胞也有类似变化。这为 CLPB 相关疾病机制研究提供新方向。

　　在细胞的微观世界里，蛋白质的正常状态对细胞功能至关重要。当蛋白质异常聚集时，就如同细胞内的 “捣乱分子”，会引发各种疾病。为了应对这些 “捣乱分子”，细胞进化出了专门的蛋白质解聚酶，其中位于线粒体膜间隙（IMS）的酪蛋白水解酶 B 蛋白同源物（CLPB，也称为 SKD3）备受关注。CLPB 作为线粒体解聚酶，其功能异常与多种人类疾病相关，如神经发育障碍、中性粒细胞减少症以及 3 - 甲基戊二酸尿症等。然而，CLPB 对线粒体功能影响的具体机制仍不明确，尤其是它与线粒体钙信号传导和融合动力学之间的关系，这就像隐藏在细胞深处的谜团，亟待科学家们去解开。

为了揭开这个谜团，来自意大利帕多瓦大学、美国托马斯杰斐逊大学等多个研究机构的研究人员展开了深入研究。他们通过一系列实验，发现 CLPB 在线粒体钙信号传导和融合动力学中起着关键的调控作用。这一重要发现发表在《Nature Communications》杂志上，为理解线粒体相关疾病的发病机制提供了新的视角。

研究人员采用了多种关键技术方法来开展研究。在细胞模型构建方面，利用 HAP1 细胞构建 CLPB 基因敲除（KO）模型，以及在 HeLa 细胞中进行 CLPB 的急性沉默和过表达实验；在蛋白检测分析上，运用免疫印迹技术检测线粒体钙单向转运体（mtCU）各组分、OPA1 等蛋白的表达水平；通过荧光成像技术，如共聚焦显微镜成像观察线粒体形态和融合事件，利用荧光寿命成像显微镜（FLIM）测量线粒体基质 Ca^{2 +}浓度（[Ca^{2 +}] _m ）等。此外，还对患者来源的皮肤成纤维细胞进行分析，以探究 CLPB 基因突变对线粒体功能的影响。

研究结果如下：

• CLPB 缺失改变 mtCU 组分丰度：通过对 WT 和 CLPB KO HAP1 细胞全细胞裂解物的免疫印迹分析，发现 CLPB 缺失导致 mtCU 的调节组分 MICU1、MICU2 和成熟形式的 EMRE（m - EMRE）水平降低，而孔形成亚基 MCU 水平升高，MICU1 - MICU2 二聚体减少。在 HeLa 细胞中进行 CLPB 急性沉默和过表达实验，结果与 HAP1 细胞模型一致。进一步研究发现，CLPB 通过防止 mtCU 组分聚集和蛋白水解来发挥作用，且急性下调 CLPB 可能轻度诱导线粒体未折叠蛋白反应（UPR_mt ）。
• 线粒体 Ca^{2 +}信号受 CLPB 缺失抑制：在完整的 WT、CLPB KO 和 CLPB 拯救细胞中，同时成像细胞质和线粒体基质中的 [Ca^{2 +}]，结果显示 CLPB 缺失不影响细胞质 Ca^{2 +}信号，但抑制了线粒体 [Ca^{2 +}] 的上升，且降低了静息 [Ca^{2 +}] _m 。在 HeLa 细胞中进行急性 CLPB 沉默实验，得到了类似的结果，并且证实线粒体 Ca^{2 +}动力学依赖于 CLPB。
• CLPB 靶向影响线粒体 Ca^{2 +}摄取和线粒体膜电位：对 CLPB 沉默的 HeLa 细胞进行线粒体 Ca^{2 +}摄取实验，发现其 Ca^{2 +}积累速率和速度均低于 WT 细胞，且该现象独立于细胞质 Ca^{2 +}瞬变和内质网与线粒体之间的高 Ca^{2 +}微区。同时，测量线粒体膜电位（ΔΨ _m ）发现，CLPB 缺失不太可能是线粒体 Ca^{2 +}清除抑制和线粒体 Ca^{2 +}信号减少的主要原因，表明 mtCU Ca^{2 +}通道活性受损在 CLPB KO 缺陷细胞中起重要作用。此外，CLPB 沉默不影响氧化磷酸化（OXPHOS）相关蛋白含量，但可能增加细胞氧化应激。
• CLPB 缺失导致线粒体碎片化和融合不稳定：研究发现 CLPB 缺失会降低 OPA1 水平，导致线粒体碎片化。通过对 OPA1 不同形式的分析，发现 CLPB 缺失改变了 OPA1 的加工过程。利用线粒体基质靶向的光转化荧光蛋白 mtDendra2 评估线粒体融合活性，结果显示 CLPB KO 细胞的线粒体融合活性降低，融合事件不稳定，多为吻 - 跑融合事件。在 HeLa 细胞中进行急性 CLPB 沉默实验，也得到了类似的结果，表明 CLPB 在维持线粒体形态和融合动力学中起重要作用。
• 患者来源皮肤成纤维细胞的线粒体变化：对携带 CLPB 基因突变的患者来源皮肤成纤维细胞进行分析，发现不同突变导致 mtCU 组分表达改变，部分细胞出现 OPA1 和 MICU2 聚集。线粒体 Ca^{2 +}摄取和静息 [Ca^{2 +}] _m 也发生变化，且线粒体结构异常，影响了线粒体呼吸功能。在 HeLa 细胞和 CLPB KO HAP1 细胞中过表达患者突变的 CLPB，再现了患者细胞中的表型。

研究结论和讨论部分指出，本研究通过多种细胞模型和测量方法，全面揭示了 CLPB 在维持线粒体 Ca^{2 +}信号传导和融合动力学中的关键作用。CLPB 通过维持 mtCU 和 OPA1 的稳定性以及相关 AAA 蛋白酶的功能，调节线粒体功能。CLPB 缺失导致的病理表型与 mtCU 和 OPA1 突变患者的特征有相似之处，这为理解 CLPB 相关疾病的发病机制提供了新的潜在机制，也为治疗涉及线粒体膜间隙蛋白处理受损的疾病提供了新的治疗靶点和方向。