幽门螺杆菌 fliK 基因在生物膜形成中的关键作用及潜在治疗意义

《mSphere 3.7》：The impact of the flagellar protein gene fliK on Helicobacter pylori biofilm formation

本文揭示幽门螺杆菌（H. pylori）fliK基因对生物膜形成、生长及黏附能力的影响。

　　

幽门螺杆菌的危害与治疗困境

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是一种革兰氏阴性、螺旋或杆状的微需氧菌，它拥有独特的鞭毛结构，主要栖息在胃上皮细胞表面附近的黏液层。别看它个头小，危害可不小，H. pylori感染是引发萎缩性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的主要原因，如果不及时清除，还可能进一步发展成胃癌。

然而，治疗H. pylori感染如今成了全球健康领域的一大挑战。由于抗生素耐药问题，全球指南推荐的一线和挽救治疗方案都面临着约 10% - 30% 的失败率。据研究，全球范围内，H. pylori对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐药率分别达到了 27.2%、39.7% 和 22.5%。

生物膜与幽门螺杆菌耐药

细菌生物膜是被胞外聚合物（EPS）包裹、附着在固体表面的细菌聚集体。H. pylori形成的生物膜就像一层坚固的 “防护盾”，将细菌与外界环境隔开，大大降低了抗生素的渗透能力。不仅如此，生物膜中H. pylori的球形形态以及各种外排泵基因的上调，都使得细菌对抗生素的耐药性显著增强。研究发现，具有更强生物膜形成能力的H. pylori菌株，其多重耐药水平也更高。有研究表明，用 N - 乙酰半胱氨酸预处理，可抑制生物膜形成、促进其瓦解，进而有效克服抗生素耐药性，提高H. pylori的根除率。

鞭毛结构与生物膜形成的关联

H. pylori的鞭毛结构和大多数革兰氏阴性肠道细菌类似，由基体、钩和丝状体三部分组成。鞭毛在H. pylori的定植和持续感染过程中发挥着重要作用，它能诱导促炎因子的分泌，增强感染部位的炎症反应。近年来的研究还发现，H. pylori的鞭毛与生物膜形成密切相关。在生物膜状态下的H. pylori中，与鞭毛结构和生物合成相关的基因表达上调。同时，在鞭毛结构基因突变菌株中，生物膜结构中的细菌生物量明显减少，这表明H. pylori的鞭毛结构有助于生物膜的形成。

研究 fliK 基因的意义

基于此前的转录组研究发现，在形成生物膜的H. pylori中，包括fliK基因在内的多个鞭毛结构蛋白基因表达显著高于非生物膜形成的菌株。本研究团队前期还发现，特定的热处理在抑制H. pylori生物膜形成的同时，fliK基因的表达水平也明显下降。fliK基因编码的钩长控制蛋白，在鞭毛结构组装过程中起着 “检查点控制” 的关键作用，监测鞭毛钩是否达到最佳长度。虽然在其他物种中已有关于fliK基因与细菌生物膜形成关系的研究，但在H. pylori中，fliK基因的功能研究还十分有限。本研究旨在深入探究fliK基因在H. pylori生物膜形成中的作用。

研究结果

1. fliK 基因敲除改变鞭毛结构：研究人员运用同源重组技术，成功敲除了H. pylori NCTC 11637 菌株中的fliK基因。通过 PCR 验证，确认了fliK基因被卡那霉素抗性基因（kan^R）成功替换。透射电子显微镜观察发现，野生型菌株有着典型的弯曲长鞭毛，厚度均匀，附着在细菌细胞的一极；而 ΔfliK突变株则出现了多钩结构，或者缺乏典型的鞭毛形态，这表明fliK基因的缺失会导致H. pylori形成多钩结构，阻碍正常鞭毛丝的组装。
2. fliK 基因缺失影响细菌运动和生长：在半固体琼脂实验中，野生型 NCTC 11637 菌株在微需氧条件下培养 7 天后，细菌扩散的最大直径可达 1.04 ± 0.06 cm，而 ΔfliK突变株仅为 0.14 ± 0.03 cm，这说明fliK基因的缺失显著削弱了H. pylori的运动能力。在生长曲线实验中，无论是在固体培养基还是液体培养基中，ΔfliK突变株的生长速度都明显慢于野生型菌株，这表明fliK基因缺失不仅影响细菌运动，还降低了其在不同培养环境中的生长速率。
3. fliK 基因影响幽门螺杆菌对胃上皮细胞的黏附：通过将野生型和 ΔfliK菌株与胃上皮 GES - 1 细胞共培养实验发现，fliK基因的缺失降低了细菌对细胞的黏附能力，但对空泡细胞毒性没有明显影响。这说明fliK基因在H. pylori黏附胃黏膜细胞的过程中发挥着重要作用，而其缺失并不影响细菌产生空泡细胞毒性的能力。
4. fliK 基因缺失减少幽门螺杆菌生物膜形成：经过结晶紫染色和荧光显微镜观察发现，与野生型菌株相比，ΔfliK突变株形成的生物膜明显减少。野生型 NCTC 11637 菌株形成的生物膜厚度约为 30 μm，边缘光滑、界限清晰；而 ΔfliK突变株形成的生物膜厚度仅约 15 μm，且稀疏、边缘粗糙。这充分表明fliK基因的缺失显著降低了H. pylori形成生物膜的能力。
5. fliK 基因缺失改变生物膜基质成分：对在玻璃盖玻片上生长的生物膜进行分析，用不同荧光染料染色后在激光共聚焦显微镜下观察发现，fliK基因缺失导致生物膜基质中的多糖和 DNA 成分显著减少，而蛋白质含量基本保持不变。这说明fliK基因在维持H. pylori生物膜基质成分的平衡方面起着重要作用。
6. fliK 基因缺失不改变幽门螺杆菌的抗生素耐药性：采用 E - test 法检测发现，fliK基因的缺失并没有改变H. pylori对常用抗生素（克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林、四环素和左氧氟沙星）的耐药性。这表明fliK基因可能不是通过直接影响浮游细菌的耐药性来发挥作用，虽然它可能通过影响生物膜形成间接影响细菌耐药性，但在本研究中未观察到这种直接关联。

讨论

1. fliK 基因对鞭毛结构的影响：FliK 蛋白由fliK基因编码，在细菌中起着分子尺的作用。它由 N 端结构域（FliKN）和 C 端结构域（FliKC）组成，FliKN 与钩帽蛋白 FlgD 和钩蛋白 FlgE 相互作用，测量鞭毛钩的长度；FliKC 则与输出开关蛋白 FlhB 相互作用，控制从钩组装到丝状体组装的转换。在不同细菌中，fliK基因和 FliK 蛋白对鞭毛的调控作用存在差异。在Salmonella中，FliK 不同结构域的突变会影响鞭毛钩的长度；在Campylobacter jejuni中，fliK缺失突变株会出现异常的 “多钩” 鞭毛结构；在Bacillus thuringiensis菌株 Bt407 中，fliK缺失突变株在原子力显微镜下观察不到鞭毛结构。在H. pylori中，此前的研究也表明，fliK突变会影响几乎所有鞭毛调节因子的转录，导致鞭毛基因表达失调。本研究的观察结果与这些发现一致，进一步证实了fliK基因在H. pylori鞭毛结构形成中的关键作用。
2. 鞭毛与细菌运动、生物膜形成的关系：H. pylori通过 2 - 6 根极鞭实现运动，这种鞭毛介导的运动系统使其能够在高粘性的胃黏液中高效游动。鞭毛在生物膜形成的各个阶段都发挥着重要作用，鞭毛运动参与细菌的黏附过程，缺乏正常鞭毛结构会减缓生物膜的组装，而鞭毛丝则有助于维持生物膜在生物和非生物表面的完整性。本研究中，ΔfliK菌株鞭毛结构的改变导致其运动能力下降，进而影响了生物膜的形成，这与以往关于鞭毛在细菌运动和生物膜形成中作用的研究结果相呼应。
3. fliK 基因对生物膜成分及细菌其他特性的影响：在其他细菌中，鞭毛结构和功能的完整性会影响生物膜 EPS 成分的变化。例如，在Pseudomonas aeruginosa和Pseudomonas putida中，参与鞭毛基因表达的转录调节因子 FleQ，通过 c - di - GMP 依赖的方式控制细胞外多糖的合成，从而影响生物膜 EPS 成分；在Bacillus subtilis中，EpsE 与 FliG 相互作用，既能抑制鞭毛旋转，又作为 EPS 生物合成酶，共同促进生物膜的形成。在H. pylori中，fliK基因缺失导致生物膜中多糖和 DNA 成分减少，虽然目前还没有关于H. pylori生物膜 EPS 成分的相关报道，但本研究结果为进一步探究其生物膜成分的调控机制提供了线索。

H. pylori的致病机制与其黏附能力和毒力因子密切相关。fliK基因缺失导致细菌黏附能力下降，但空泡细胞毒性没有明显变化。H. pylori主要通过细菌黏附素与宿主细胞结合实现黏附，鞭毛调节基因突变会影响细菌对宿主细胞的黏附，推测fliK基因可能参与调节H. pylori黏附素的合成。而空泡细胞毒性主要由空泡毒素（VacA）引起，其活性可能独立于细菌黏附，目前尚无证据表明鞭毛基因会影响空泡细胞毒性。

此外，研究还发现fliK基因缺失显著减缓了细菌的生长速度。在其他细菌中，鞭毛和细菌增殖之间存在相互影响，鞭毛的组装过程可能也会影响H. pylori的增殖，但具体机制还需要进一步深入研究。

4. 研究的局限性与展望：本研究存在一定的局限性，即缺乏对 ΔfliK突变株的基因互补实验。不过，研究人员通过精确的同源重组技术删除fliK编码序列，同时保留了相邻基因序列，且突变株的鞭毛结构改变表型与其他相关研究中的报道相似，这在一定程度上证明了观察到的表型变化确实是由fliK功能缺失引起的。未来，还需要进一步研究fliK基因对H. pylori生物膜形成的调控机制，这将为深入了解H. pylori的致病机制以及开发新的治疗策略提供重要依据。

综上所述，本研究系统地探究了fliK基因对H. pylori多种表型的影响，发现fliK基因缺失显著影响细菌生物膜的形成，减少了生物膜中的多糖和 DNA 等成分。这些研究结果为H. pylori生物膜的研究提供了新的视角，也为开发针对H. pylori感染的潜在治疗策略奠定了基础。相信在未来，随着对H. pylori研究的不断深入，人们将能够更有效地应对这一困扰全球健康的难题。