球孢白僵菌 CFEM 家族基因：在铁饥饿环境下的功能分化与补偿机制

《Microbiology Spectrum 3.7》：The virulence contribution of the CFEM family genes of Beauveria bassiana is closely influenced by the external iron environment

本文系统研究球孢白僵菌（Beauveria bassiana）中 BbCFEM 家族基因功能，揭示其在铁饥饿下的作用机制。

　　### 球孢白僵菌 CFEM 家族基因：在铁饥饿环境下的功能分化与补偿机制
在生物防治领域，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）作为一种重要的昆虫病原真菌，广泛用于害虫控制。其感染害虫的过程十分独特，当球孢白僵菌的分生孢子接触到节肢动物宿主时，会通过机械压力和分泌各种体表降解酶促使孢子萌发形成芽管，随后感染菌丝穿透宿主体表，经二型转变进入昆虫血腔，在血腔内大量繁殖。宿主因真菌感染死亡后，腐生状态的菌丝会穿出宿主体表并覆盖全身，产生大量分生孢子，进而开启新的感染循环。

真菌拥有一套严谨的铁获取系统，其核心是由 bZIP 型转录因子 Hap 和 GATA 型转录因子 Sre 形成的负反馈调节系统，以此维持真菌体内的铁平衡。此外，真菌还具备多种铁吸收机制，如还原铁同化、Fe - 载体调节的 Fe³⁺吸收以及铁 - 血红素吸收系统。真菌细胞外膜（CFEM）结构域是真菌细胞外膜蛋白的组成部分，含有八个保守的半胱氨酸残基，能够捕获血红素，在真菌的感染和定殖过程中发挥着关键作用。在多种真菌中，CFEM 结构域蛋白都展现出重要功能，比如稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中 Pth11 的 CFEM 结构域参与疏水性、感染、表面感知和过度产孢过程；白色念珠菌（Candida albicans）的 CFEM 蛋白维持细胞壁结构；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的 CFEM 结构域蛋白也在细胞壁结构中起关键作用。不过，CFEM 蛋白在不同真菌中的功能存在差异，部分基因功能明确，而有些基因功能较弱或无明显作用。在球孢白僵菌中，虽然已鉴定出 12 个 CFEM 结构域蛋白，但多数 BbCFEM 基因在感染昆虫时对真菌毒力的促进作用尚不明确，且在不同铁条件下，BbCFEM 基因的功能分化和补偿机制也有待研究。

基于此，本研究提出假设：BbCFEM 基因对真菌毒力和胁迫耐受性的贡献会因外界铁的可利用性不同而有所差异。围绕这一假设，研究人员开展了一系列实验，系统地探究了球孢白僵菌野生型菌株和 11 个 CFEM 家族基因敲除菌株在感染大蜡螟（Galleria mellonella）时的毒力变化，并深入分析了在不同铁饥饿条件下 CFEM 家族基因的功能分工以及基因间的功能补偿现象。这一研究为系统解析真菌 CFEM 结构域基因功能提供了新方向，为分析昆虫病原真菌在不同环境中的毒力提供了理论依据，对生物防治真菌在害虫防治中的应用具有重要意义。

材料与方法

实验所用的球孢白僵菌野生型（WT）ARSEF2860 菌株购自美国农业部昆虫病原真菌保藏中心，ΔBbCFEM1 - ΔBbCFEM11 突变菌株则按照之前描述的方法构建。WT 和突变菌株均在 SDAY 平板（含 4% 葡萄糖、1% 蛋白胨、1% 酵母提取物和 1.5% 琼脂糖）上于 25°C 保存，以察氏琼脂（CZA，含 3% 葡萄糖、0.3% NaNO₃、0.1% K₂HPO₄、0.05% KCl、0.05% MgSO₄、0.001% FeSO₄和 1.5% 琼脂）作为化学限定培养基。

在评估真菌生长和胁迫反应实验中，研究人员参照以往方法对 WT 和突变菌株的真菌表型进行检测，每个实验重复三次。通过在 CZA 培养基中添加不同碳源（3% 葡萄糖、3% 蔗糖、3% 海藻糖、3% 半乳糖、3% 麦芽糖、3% 乳糖和 3% 甘露糖）和氮源（0.3% NaNO₂、3% NH₄Cl、3% (NH₄)₂SO₄、3% N - GluNAc、3% 明胶和 3% 几丁质）来评估营养生长情况；利用添加 0.02 mM 甲萘醌、2 mM H₂O₂、1.2 M 山梨醇、0.5 M NaCl、6 μg/mL 刚果红和 3 mM Zn²⁺的 CZA 平板来研究真菌在胁迫条件下的生长。将在 SDAY 平板上生长的分生孢子悬浮于 0.02% 吐温 - 80 中，使其终浓度达到 10⁶/mL，取 1 μL 悬浮液接种到相应平板上，于 25°C 培养 7 天后测量菌落直径。

在铁饥饿条件下测定真菌毒力实验中，以大蜡螟幼虫作为生物测定宿主来评估分生孢子的毒力。在 SDAY 平板上培养 8 天后收获各菌株的分生孢子，用于局部感染时，将幼虫浸入浓度为 10⁷/mL 的分生孢子悬浮液中 15 秒，以 0.02% 吐温 - 80 作为空白对照；用于血腔内注射感染实验时，将 5 μL 浓度为 10⁵个 /mL 的分生孢子悬浮液注入宿主血腔。通过在分生孢子悬浮液中添加 0.4 mM 的 bathophenanthroline disulfonate（BPS）来控制铁水平。每个处理设置三个重复，每个重复包含 30 - 40 只昆虫。在感染后 3 - 6 天，每 12 小时记录一次死亡率，6 - 10 天则每 24 小时记录一次。利用 Kaplan - Meier 方法计算各菌株的半数致死时间（LT₅₀），并通过 log - rank 检验计算各菌株配对曲线之间的差异。

在定量实时逆转录聚合酶链反应（RT - qPCR）实验中，取 100 μL 浓度为 1×10⁶个 /mL 的分生孢子悬浮液涂抹在覆盖有玻璃纸的 SDAY 平板上，于 25°C 培养 3 天，随后按照 RNAiso Plus 试剂（TaKaRa）的操作说明提取总 RNA。使用 Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time for qPCR（TaKaRa）将总 RNA 合成第一链 cDNA，利用 SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）和配对引物进行 qPCR 分析，以真菌 β - actin 基因的转录本作为内参，通过 2^?ΔΔCT技术测定每个基因的相对表达量，实验中使用的引物详见表 S1。

所有统计分析均借助 GraphPad Prism 8 软件完成，数据以平均值 ± 标准差表示。两组数据比较采用非配对 Student’s t 检验，多组数据比较则采用单因素方差分析，随后进行 Tukey’s post hoc 检验，当 P < 0.05 时被认为具有统计学意义。

结果

研究人员检测了 BbCFEM 基因缺失对真菌营养生长的影响，发现在不同碳源和氮源条件下，ΔBbCFEM7 和 ΔBbCFEM8 菌株在葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖和蔗糖上的生长明显受限；ΔBbCFEM1、6、7、8、9 和 11 菌株在甘露糖上的营养生长显著下降；在氮源方面，ΔBbCFEM7 和 ΔBbCFEM8 菌株的菌落直径明显减小，而其他突变菌株在所有氮源的 CZA 培养基上培养时未出现生长缺陷。这表明 BbCFEM7 和 BbCFEM8 基因对球孢白僵菌的生长有显著影响，在响应碳源和氮源时对真菌生长的作用最为突出。

化学胁迫是影响真菌适应性的重要因素。研究人员系统测试了 BbCFEM 家族基因对多种化学胁迫剂的反应，发现除 ΔBbCFEM9 外，几乎所有突变菌株对刚果红胁迫的敏感性都显著增加；ΔBbCFEM6、7、8 和 11 菌株对 Zn²⁺胁迫的敏感性增强；BbCFEM7、8 和 11 突变体对山梨醇胁迫表现出明显的敏感性。此外，BbCFEM 家族基因突变体在暴露于 NaCl、甲萘醌和 H₂O₂时，整体趋势相似。这说明 BbCFEM 基因的破坏会对球孢白僵菌在多种胁迫下的生长产生不同影响。

先前研究表明 BbCFEM 基因有助于球孢白僵菌的毒力。本研究通过分析大蜡螟的存活率来探究铁在 BbCFEM 基因致病性中的作用。在分生孢子悬浮液中添加铁螯合剂 BPS（0.4 mM）诱导铁饥饿后，无论是局部感染还是注射感染，BbCFEM 基因缺失菌株的毒力都受到显著影响。铁饥饿对 WT 菌株在局部感染中的存活曲线无明显影响，但显著降低了 ΔBbCFEM1、2、3、4、6、8、9、10 和 11 菌株的毒力，同时显著提高了 ΔBbCFEM5 和 7 菌株的毒力。LT₅₀结果显示，ΔBbCFEM1、3、7 和 10 在 0.4 mM BPS 条件下的毒力明显低于适宜铁条件下的毒力，但野生型菌株与 CFEM 家族敲除菌株之间的毒力并无显著差异。

有趣的是，在 ΔBbCFEM1、3 和 10 菌株中，铁饥饿诱导的死亡率未超过 50%。血腔内注射实验结果与局部感染相似，铁饥饿未显著改变 WT 菌株的毒力，但显著降低了 ΔBbCFEM1、2、3、4、8 和 11 菌株的毒力，同时提高了 ΔBbCFEM7 和 9 菌株的毒力。这表明 BbCFEM 基因通过获取铁来促进真菌毒力，ΔBbCFEM1、3、4、8、11 菌株在 0.4 mM BPS 条件下的毒力显著低于适宜铁条件下的毒力，而 ΔBbCFEM5 菌株在 0.4 mM BPS 时的毒力则显著高于中等铁水平时的毒力，野生型菌株与其他 CFEM 家族基因敲除菌株的毒力差异不显著。

基于表型和毒力数据，研究人员选取 ΔBbCFEM3、7 和 8 菌株来检测其他 BbCFEM 基因的表达，以确定 BbCFEM 基因之间是否存在补偿效应。结果发现，BbCFEM3 基因缺失显著上调了 BbCFEM1、7、9 和 11 基因的表达，同时显著下调了 BbCFEM2、4、6、10 和 12 基因的表达；BbCFEM7 基因敲低显著增加了 BbCFEM1、2、3、5、8 和 11 基因的表达，同时显著降低了 BbCFEM8 和 12 基因的表达；BbCFEM8 基因缺失显著上调了 BbCFEM1、2、3、4、5、7、9、11 和 12 基因的表达，显著下调了 BbCFEM10 基因的表达。这些结果表明 BbCFEM 基因在真菌铁获取过程中具有补偿作用。

讨论

InterPro 数据库中包含超过 6000 条 CFEM 序列，但并非所有 CFEM 蛋白都能结合血红素，这意味着 CFEM 家族蛋白获取的铁除了血红素，可能还来源于强大的 Fe²⁺/Fe³⁺，CFEM 家族可能存在更多潜在的铁获取机制。本研究通过注射感染和体壁感染，报道了球孢白僵菌 11 个 CFEM 结构域蛋白在 0.4 mM BPS 条件下对真菌毒力的贡献。结果显示，在严重铁饥饿条件下，部分 CFEM 家族基因的毒力贡献与中等铁条件下显著不同，既有毒力增强的情况，也有毒力降低的情况，这表明 BbCFEM 家族基因在不同铁饥饿条件下的贡献存在差异。

进一步比较分析发现，在中等铁（0 mM BPS）、中等铁饥饿（0.2 mM BPS）和严重铁饥饿（0.4 mM BPS）条件下，体壁感染时铁饥饿的影响显著降低，同一基因在不同铁饥饿条件下对真菌毒力的贡献也不同。例如，BbCFEM6 在中等铁条件下的独立贡献较小，在中等和严重铁饥饿条件下贡献显著，且在中等铁饥饿条件下的毒力贡献明显优于严重铁饥饿条件。血腔注射组也观察到类似模式，如 BbCFEM11 对真菌毒力的贡献随铁饥饿程度增加而增加。本研究总结了 BbCFEM 家族基因在不同铁饥饿水平下的分工，BbCFEM7 和 8 在所有条件下都有助于真菌毒力；BbCFEM1、2、3、4 和 11 在严重铁饥饿下能显著促进真菌毒力；BbCFEM5、6、9 和 10 在轻度铁饥饿条件下的表现优于严重铁饥饿条件。这一研究揭示了 CFEM 结构域基因在不同铁环境中的功能分布，有助于了解病原真菌在自然界中的进化策略，以及适应环境和种群繁殖的机制。此外，研究结果还表明，在中等铁饥饿条件下，只有 BbCFEM7 和 8 在局部感染和注射感染条件下都对真菌毒力有贡献，而在中等和严重铁饥饿条件下，更多的 BbCFEM 家族成员被激活并发挥毒力。这意味着在应用球孢白僵菌等生物防治真菌时，可以适当结合铁螯合剂以适应不同的铁环境。

近年来，一些研究揭示了 CFEM 家族基因的生理机制，该家族基因能够获取铁，参与生物膜形成等过程。在本研究中，ΔBbCFEM7 和 8 对山梨醇胁迫敏感，表明它们作为外膜蛋白的组成部分，直接影响细胞壁的完整性；ΔBbCFEM1、2、3、4、5、6、10 和 11 对 H₂O₂胁迫敏感，ΔBbCFEM3、4、5、6、7、8、10 和 11 对甲萘醌敏感，BbCFEM7 和 8 对 NaCl 敏感。这些结果表明 BbCFEM 家族基因在促进铁获取、应对细胞壁应激和氧化应激方面发挥作用，与植物和人类病原真菌的情况一致。在绿僵菌（M. acridum）感染蝗虫的研究中，MaCFEM1 缺失会导致昆虫宿主肠道内机会性细菌迅速增殖，进而导致昆虫死亡，这体现了 CFEM 结构域基因在不同真菌中毒力作用的差异以及适应性进化。

基因家族成员通常具有相似的序列和功能，存在基因冗余现象，当某个基因家族成员受到抑制或失活时，其他成员的表达水平可能会升高以补偿其功能。这种转录调控机制可能受外部信号调节，在 BbCFEM 家族中也观察到了类似现象。本研究中，BbCFEM3、7 和 8 基因的敲低导致家族其他成员的 RNA 表达上调，这种上调能够补偿家族中某个基因缺失所造成的损害。基因家族中的冗余和补偿机制是生物体适应不同环境的关键，在环境胁迫（如温度、缺氧等）下，一些基因家族的补偿能力能够提高生物体的存活率。

真菌拥有多个基因家族，为物种在不同生态位的进化提供了重要支持。研究昆虫病原真菌中的基因家族功能，如 SOD 家族和 MARVEL 家族，有助于深入了解真菌的生物学特性。本研究证实 BbCFEM 家族参与真菌铁饥饿反应途径的调控，增进了对真菌基因家族功能分工的认识。

然而，本研究也存在一些不足之处。目前仅在一株球孢白僵菌中报道了 CFEM 家族结构域基因，未对更多菌株进行研究以验证该家族基因的功能分化和补偿现象；此外，BbCFEM 家族基因的补偿现象在蛋白质表达水平上有待验证，其补偿机制在不同真菌物种中的情况也需要进一步探索。

综上所述，本研究揭示了 BbCFEM 基因在不同铁条件下的功能分化和补偿机制。该家族基因通过在铁饥饿环境中的补偿和合理分工，帮助真菌在腐生环境、昆虫体表感染阶段、昆虫血腔增殖以及腐生阶段竞争和获取生物铁，从而促进真菌的分化和毒力。这为解释昆虫病原真菌感染多种宿主时毒力的特异性和不平衡性提供了新的理论依据，但 BbCFEM 家族实现这种补偿机制的具体过程仍有待进一步研究。

结论

球孢白僵菌的 CFEM 家族基因（1 - 11）在响应不同碳氮源、抵抗化学胁迫生长以及毒力方面的贡献存在差异。除 BbCFEM7 和 BbCFEM8 外，大多数 CFEM 结构域基因在营养生长中未发挥关键作用。多数基因影响真菌对细胞壁应激和不同铁饥饿条件的反应，无论是体壁感染还是注射感染。此外，BbCFEM 家族中单个基因的缺失会导致家族其他成员上调表达，表明该家族基因之间存在功能补偿机制。本研究为深入理解昆虫病原真菌的基因家族以及它们感染害虫的机制提供了新的视角。