B 族链球菌表面免疫原性蛋白 Sip：母婴健康的关键靶点与潜在治疗新方向

《Infection and Immunity》：A CRISPRi library screen in group B Streptococcus identifies surface immunogenic protein (Sip) as a mediator of multiple host interactions

本文利用 CRISPR 干扰（CRISPRi）技术研究 B 族链球菌（GBS）表面蛋白，发现 Sip 可调节巨噬细胞细胞因子反应，或为治疗及疫苗研发提供新方向。

　　

引言

B 族链球菌（Streptococcus agalactiae，GBS）作为一种重要的共生致病菌，悄无声息地栖息在约三分之一健康成年人的肠道和生殖道中。然而，在孕期、新生儿期和婴儿期这些特殊阶段，它却摇身一变，成为威胁健康的 “杀手”，引发一系列严重的感染。GBS 在人体宿主内展现出极强的适应性，能在肠道、阴道、子宫、新生儿血液以及脑脊液等多个部位存活并繁殖，其在围产期的致病性，很大程度上源于它能巧妙地逃避先天和适应性免疫清除，在受到解剖和免疫保护的妊娠相关部位安营扎寨。

GBS 的表面特征在其与宿主环境的相互作用中起着关键作用。其富含唾液酸的多糖荚膜，犹如一层坚固的 “铠甲”，不仅有助于免疫逃避，还能促进生物膜形成和上皮定植，同时影响白细胞的细胞因子反应。而在荚膜内外，还有众多表面锚定和分泌蛋白，它们同样 “各司其职”。例如，菌毛蛋白帮助 GBS 附着在宿主表面并形成生物膜；HvgA 作为一种黏附素，在新生儿肠道黏附、跨壁侵袭以及穿越血脑屏障等过程中发挥重要作用；丝氨酸重复蛋白（Srr1 和 Srr2）则是重要的黏附素，在围产期 GBS 发病机制中扮演关键角色；C5a 肽酶通过切割补体来逃避免疫清除，同时还兼职黏附素的角色。此外，还有一些表面转运蛋白参与环境溶质的检测与信号转导，以及细胞内外的化学物质交换。

尽管对 GBS 表面转运蛋白的研究已经取得了一定进展，但传统的基因编辑技术存在效率低下、易产生意外重排等问题，严重限制了对这些蛋白功能的大规模、系统性研究。CRISPR 干扰（CRISPRi）技术的出现，为解决这一难题带来了新的希望。它通过催化失活的 Cas 蛋白（dCas）在特定基因组位点阻断转录，避免了传统基因敲除方法的诸多弊端，能够更高效地研究特定基因集的功能。在本研究中，科研人员利用 CRISPRi 技术构建了一个靶向 GBS 表面转运蛋白编码基因的文库，深入探究这些蛋白在调节巨噬细胞细胞因子反应中的作用。

研究结果

1. 保守 GBS 表面转运蛋白的生物信息学鉴定：科研人员借助美国能源部联合基因组研究所的综合微生物基因组和微生物组系统（IMG/M）提供的生物信息工具，对公开的 GBS 基因组进行深入分析。他们首先从 CNCTC 10/84 菌株基因组中筛选出带有信号肽的基因，然后在 654 个 GBS 基因组中进行比对，最终确定了 66 个保守的表面转运蛋白基因。这些基因编码的蛋白，在 GBS 与宿主的相互作用中极有可能发挥着重要作用。随后，通过 SignalP 服务器对这些基因序列进行分析，进一步证实了目标基因集起始位置存在信号肽序列。
2. CRISPRi 文库的构建与验证：基于先前建立的 CRISPRi 克隆方法，研究人员针对筛选出的 66 个保守表面转运蛋白基因构建了 CRISPRi 文库。他们利用 CRISPick 服务器设计靶向这些基因的单链引导 RNA（sgRNA）序列，并将其克隆到表达质粒 p3015b 中。经过一系列复杂的操作，包括在大肠杆菌中克隆、转化以及在 GBS 菌株 CNCTC 10/84（携带染色体整合的 dCas9）中进行转化，成功获得了 106 个转化菌株。

为了确保文库的有效性，研究人员使用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）对每个敲低菌株中目标基因的表达进行检测。结果发现，大部分敲低菌株的目标基因表达相对于对照菌株都有明显下调，但不同菌株的敲低程度存在较大差异。部分敲低效果不理想的菌株被排除在后续实验之外，最终整个文库的平均表达敲低水平为对照的 0.365。3. THP-1 巨噬细胞样细胞的细胞因子反应筛选：为了探究 GBS 表面蛋白表达受抑制时巨噬细胞的促炎反应，研究人员将分化为巨噬细胞表型的 THP-1 细胞与 86 个敲低变体（乙醇灭活处理）进行共孵育，检测细胞分泌的肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）和白细胞介素 - 1β（IL-1β）水平。实验中还纳入了 5 个基因组靶向表面蛋白定位相关伴侣的菌株作为对照。

通过统计分析发现，共有 5 个敲低菌株在 IL-1β 检测中表现出高于阈值的变化，5 个敲低菌株在 TNF-α 检测中表现出高于阈值的变化，且这些发现均为细胞因子表达增加的情况。其中，表面免疫原性蛋白（Sip）基因的敲低对 IL-1β 释放的影响最为显著，使 IL-1β 分泌增加了 3.53 倍，同时 TNF-α 分泌也增加了 2.44 倍。4. 靶向 Sip 缺失菌株促进吞噬细胞 IL-1β 分泌的机制：鉴于 Sip 在细胞因子反应中的突出表现，研究人员在 CNCTC 10/84 和 A909 两个 GBS 菌株背景下构建了 Sip 基因的框内缺失敲除突变体。通过与 THP-1 细胞的共孵育实验发现，两个突变体菌株均能显著促进 THP-1 巨噬细胞 IL-1β 的释放，A909 背景的突变体还能促进 TNF-α 的释放。

进一步研究发现，Sip 缺失导致的 IL-1β 分泌增加并非由转录水平的变化引起，而是与 NLRP3 炎性小体的激活有关。在 NLRP3 炎性小体驱动的细胞焦亡过程中，激活的半胱天冬酶 - 1（caspase-1）会切割前体 IL-1β，使其成熟并分泌。研究人员使用 caspase-1 不可逆抑制剂 Z-YVAD-FMK 处理后，发现 IL-1β 的刺激效应受到抑制，这表明 GBS 的 Sip 蛋白对 caspase-1 介导的 IL-1β 分泌具有抑制作用，Sip 缺失会导致 THP-1 巨噬细胞样细胞的细胞焦亡反应增强。5. GBS Δsip 突变体生物膜形成能力受损：GBS 能够在体内外形成生物膜，这一特性与它在阴道上皮的定植以及垂直传播风险密切相关。研究人员对 Δsip 突变体和对照菌株进行体外生物膜形成实验，结果发现，无论是在定量比色测定中，还是通过扫描电子显微镜观察，Δsip 突变体形成的生物膜都明显少于对照菌株。在 CNCTC 10/84 背景下，Δsip 突变体形成生物膜的能力相较于亲本菌株降低了 38%，相较于回复突变株降低了 41%；在 A909 背景下，Δsip 突变体形成生物膜的能力相较于亲本菌株降低了 59%，相较于回复突变株降低了 40%。这表明 Sip 在 GBS 生物膜形成过程中起着至关重要的作用。6. GBS Δsip 突变体对人胎儿膜的附着和穿透能力下降：为了探究 Δsip 突变体表面特性的改变对其与围产期感染相关组织相互作用的影响，研究人员使用人胎儿膜进行实验。通过对感染 GBS 后的胎儿膜进行染色成像和基于菌落形成单位（CFU）计数的黏附试验发现，Δsip 突变体与胎儿膜的结合明显减少，其 CFU 计数比野生型和回复突变株低 1 - 2 个对数级。这说明 Sip 的缺失显著削弱了 GBS 对人胎儿膜的附着和穿透能力。7. GBS Δsip 突变体在小鼠阴道定植和上行感染模型中子宫侵袭能力受损：研究人员利用非孕雌性 C57BL/6 J 小鼠模型，模拟 GBS 的阴道定植和上行感染过程。实验结果显示，在 7 天的阴道定植期间，Δsip 突变体与野生型菌株在阴道定植密度和定植清除率方面没有显著差异。然而，在子宫组织中，野生型菌株的 GBS 载量明显高于 Δsip 突变体，这表明 Sip 有助于 GBS 在子宫内的持续存在，而 Δsip 突变体由于缺乏 Sip，更容易被免疫清除，导致子宫侵袭能力受损。

讨论

本研究首次利用 CRISPRi 技术对 GBS 的一个大基因集在发病机制中的作用进行研究，充分展示了该技术的优势。与传统的染色体基因敲除方法相比，CRISPRi 技术能够更快速地构建特定基因的敲低菌株，且不易产生意外结果，还可用于研究必需基因或条件必需基因的功能。

然而，CRISPRi 技术也存在一些局限性。在构建文库过程中，并非所有目标基因都能成功构建敲低变体，且部分基因只能使用单个 sgRNA 进行靶向。此外，CRISPRi 介导的基因表达敲低效果存在较大差异，这可能导致不同的表型变化，因此该技术更适合作为一种筛选方法，为后续通过正式的染色体缺失进行更深入的研究提供线索。

在研究巨噬细胞对 GBS 变体的反应时，研究人员发现去除 GBS 表面蛋白后，细胞因子分泌反应呈现出从抑制到显著增强的广泛变化，这与他们最初的预期相反。这表明 GBS 表面蛋白对先天免疫的抑制作用可能是多种蛋白共同作用的结果，多个 GBS 表面转运蛋白通过不同机制逃避免疫激活，从而促进 GBS 的感染。

Sip 作为一种备受关注的 GBS 疫苗候选蛋白，本研究首次揭示了其在 GBS 生物学中的重要作用。Sip 不仅能调节巨噬细胞的细胞因子分泌，还对 GBS 的生物膜形成、与宿主组织的黏附以及在子宫内的持续存在产生显著影响。尽管 Sip 的蛋白质结构中含有一些保守结构域，如溶菌酶基序（LysM），但这些结构域的具体功能以及 Sip 在 GBS 细胞表面的作用机制仍有待进一步研究。

本研究也存在一些不足之处。首先，用于构建 CRISPRi 文库的 CNCTC 10/84 菌株在covRS操纵子启动子区域存在已知突变，这可能会影响某些表面蛋白的功能，导致研究结果的普适性受到一定限制。不过，由于 Sip 相关实验在 A909 菌株中进行，该菌株不存在此突变，在一定程度上减轻了这一担忧。其次，在巨噬细胞刺激实验中使用的是乙醇灭活的细菌，而非活细菌，这虽然避免了一些技术问题，但无法研究细菌的细胞外和细胞内生存与生长情况。最后，CRISPRi 敲低文库中存在配对的 sgRNA 对同一基因敲低程度相关性较差、细胞因子测量结果不一致的问题，其原因可能涉及 dCas9 与 DNA 的结合强度、dCas9 与 sgRNA 的结合差异、质粒拷贝数的影响以及脱靶效应等多个方面。

针对这些问题，未来研究可以利用最新的 sgRNA 优化工具设计 protospacer 序列，并增加每个目标基因的靶向 sgRNA 数量，以提高实验的准确性和可靠性。同时，进一步深入研究 Sip 在 GBS 细胞表面的作用机制、对细胞因子分泌的调节方式以及在侵袭性疾病中的功能，将为开发针对 GBS 感染的新型治疗方法和疫苗提供重要依据。

材料与方法

1. 试剂：实验中使用的各种试剂，包括细胞培养基、抗生素、核酸提取试剂盒、酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒等，均购自不同的商业公司，如 Thermo-Fisher、R&D Systems、Sigma-Aldrich 等。
2. 细菌菌株和生长条件：GBS 菌株 A909 和 CNCTC 10/84 及其衍生物在 37°C（当存在温度敏感的 pMBsacB 质粒时为 28°C）、静止条件下，在添加适量红霉素的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中培养。大肠杆菌 DH5α 用于克隆实验，在添加 300 μg/mL 红霉素的 LB 培养基中，37°C（或 28°C，当存在额外染色体 pMBsacB 时）振荡培养。
3. 保守信号肽编码基因的鉴定：通过 IMG/M 系统搜索 CNCTC 10/84 基因组中编码信号肽的基因，并与 GBS 基因组集合进行比对。利用 Profile & Alignment 工具，设置最大 E 值为 0.1，最小百分比同一性从 10% 逐步增加到 90%，记录每个基因的最大同一性百分比，以此确定保守的信号肽编码基因。
4. 表面转运蛋白 CRISPRi 文库的构建：针对 66 个保守的表面转运蛋白基因，使用 Broad Institute 的 CRISPick 服务器设计靶向 protospacer 序列。将定制的寡核苷酸退火后克隆到 sgRNA 表达质粒 p3015b 中，转化大肠杆菌 DH5α，筛选阳性克隆。提取质粒后转化电感受态 CNCTC 10/84:dCas9 菌株，获得 GBS 敲低菌株，并通过观察 mCherry 荧光蛋白表达进行初步筛选，最后保存为冷冻甘油菌液。
5. CRISPRi 靶基因表达的 RT-qPCR 检测：使用 IDT 网站的 PrimerQuest 工具设计 RT-qPCR 引物，优化用于 Bio-Rad iTaq Universal Sybr Green One-Step 试剂。从 GBS CRISPRi 文库菌株过夜培养物中提取 RNA，进行 DNA 酶处理去除基因组 DNA，然后进行逆转录和定量 PCR。基因表达定量采用 Livak 方法，以 GBS recA基因作为内参，以缺乏靶向 protospacer 的 CNCTC 10/84:dCas9 菌株作为野生型对照。
6. Sip 基因的靶向缺失：利用温度和蔗糖敏感的质粒 pMBsacB，通过同源重组的方法在 CNCTC 10/84 和 A909 菌株中删除 Sip 基因。构建包含约 500 bp 上下游同源臂的重组质粒，导入 GBS 菌株后，经过蔗糖反选择步骤，通过 PCR 筛选 Δsip 突变体和野生型回复菌株，并对菌株进行全基因组测序，确保无潜在的脱靶突变。
7. GBS 的乙醇灭活：将 GBS 菌株在 TSB 中 37°C 静置培养，经离心洗涤后重悬于冷 DPBS^+/+中，测定浓度。缓慢加入无水乙醇至最终浓度为 70%，4°C 振荡孵育 1 小时，再次洗涤并重悬。通过血琼脂平板检测和接种 THB 培养基验证细菌是否完全灭活，将乙醇灭活的 GBS（GBS^EK）分装后储存于 - 80°C，避免冻融循环。
8. THP1-Blue 细胞的培养和 PMA 处理：THP-1 Blue 细胞在含有 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（PSG）和 100 μg/mL 诺莫菌素的 RPMI 培养基（RPMI^+/+/+）中培养和传代。用终浓度为 5 ng/mL 的佛波醇 12 - 肉豆蔻酸 13 - 乙酸酯（PMA）处理细胞过夜，使其分化为巨噬细胞样细胞，然后用非酶细胞解离溶液收集细胞。
9. THP1-Blue 细胞刺激用于细胞因子分析：将 PMA 处理后的 THP1-Blue 细胞以 400,000 个细胞 / 孔的密度接种于 96 孔板，在无 FBS 和抗生素的 RPMI 培养基（RPMI^-/-）中静置 30 - 90 分钟。吸除培养基，加入新鲜 RPMI^?/?，然后加入 GBS^EK菌株（感染复数为 50:1）。部分实验中，细胞在刺激前用 10 μM 的 caspase-1 不可逆抑制剂 Z-YVAD-FMK 预处理 1 小时。刺激后，将培养板在 37°C、5% CO₂条件下孵育 22 - 24 小时，离心收集上清液，储存于 - 80°C，用于 ELISA 检测细胞因子。
10. THP-1 blue 刺激用于 qRT-PCR 分析：将 PMA 处理后的 THP-1 Blue 细胞以 5 × 10⁶个细胞 / 孔的密度接种于 6 孔板，在 RPMI^?/?培养基中静置 30 分钟。吸除培养基，加入新鲜 RPMI^?/?，然后加入 GBS^EK菌株（MOI 为 50:1），在 37°C、5% CO₂条件下孵育 4 小时。使用 TRIzol 试剂提取总 RNA，经 DNA 酶处理后，利用 Applied Biosystems ProFlex PCR 系统合成 cDNA，最后使用 SsoAdvanced Universal Supermix 和 Applied Biosystems QuantStudio 3 热循环仪进行实时 q-PCR，所有样本均进行三次重复实验，数据采用 ΔΔCt 方法分析。
11. 细胞因子的 ELISA 分析：按照人 TNF-α 和 IL-1β ELISA 试剂盒的说明书，对巨噬细胞刺激实验中的细胞因子进行检测分析。
12. 生物膜的定量分析：采用结晶紫染色法对 GBS 过夜静态培养物形成的生物膜进行定量分析。将 GBS 培养物在含有 1% 葡萄糖的 THB 中过夜培养，次日测量 OD₆₀₀评估细胞密度，洗涤后用 1% 结晶紫染色，再次洗涤干燥后，用 80% 乙醇：20% 丙酮溶液溶解结晶紫，测量 OD₅₆₀，计算总生物膜与生物量的比值。
13. ** 细菌与人胎儿膜外植