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本文聚焦金黄色葡萄球菌（S. aureus）引起的人工关节感染。研究发现细胞外黏附蛋白（Eap）及其同源物 EapH1、EapH2 可影响生物膜结构，降低其孔隙率，减少巨噬细胞对生物膜细菌的侵袭和吞噬，在体内促进细菌存活，为防治相关感染提供新靶点。
### 金黄色葡萄球菌生物膜感染现状及研究背景
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在 2024 年于美国引发众多严重感染与死亡病例。虽然控制医院细菌传播的措施曾降低了金黄色葡萄球菌严重感染的发生率，但近期效果渐缓。在人工关节置换手术中，约 1 - 3% 的全髋关节和膝关节置换术会因感染出现并发症，延长住院时间、增加翻修手术风险并降低 5 年生存率。金黄色葡萄球菌形成生物膜的能力，使其成为外科手术部位感染的重要病原体，约 20% 的手术部位感染与之相关。生物膜中的细菌对抗生素耐受性强，比浮游菌高 1000 倍，且能逃避宿主抗菌反应，在条件适宜时扩散引发全身性感染，因此研究生物膜表型对预防金黄色葡萄球菌持续感染至关重要。
细胞外黏附蛋白（Eap）是金黄色葡萄球菌生物膜基质中的主要蛋白，能广泛结合宿主蛋白、细菌和宿主 DNA。此前研究表明，Eap 在浮游菌感染中有抗炎和抗血管生成作用，在压力条件下对生物膜形成有贡献，但在生物膜生长中作为毒力因子的作用研究较少。此外，金黄色葡萄球菌还表达 Eap 的两个功能孤儿 EapH1 和 EapH2，可保护细菌免受中性粒细胞衍生蛋白酶的攻击。巨噬细胞在对金黄色葡萄球菌的免疫反应中起关键作用，本研究旨在探究 Eap、EapH1 和 EapH2 对巨噬细胞侵袭和吞噬金黄色葡萄球菌生物膜细菌的影响，以及它们在体内人工关节感染中的作用。
Eap 蛋白对生物膜生物量和结构的影响
为探究 Eap 在生物膜发育中的作用，研究人员对比了最常见的金黄色葡萄球菌谱系 USA300（野生型，WT）和缺失 eap、eapH1 和 eapH2 基因的同基因突变体（Δeap）的生物膜生物量。通过结晶紫实验发现，培养 24 小时后，Δeap 细菌的生物膜生物量显著低于 WT。免疫调节蛋白 IsaB 也是生物膜外蛋白质组中大量表达的 DNA 结合蛋白，研究人员构建了 Δeap 背景下 isaB 基因的突变体，结果显示，缺失 IsaB 和三种 Eap 蛋白的细菌形成的生物膜生物量与 Δeap 细菌相当，表明 IsaB 在体外对生物膜生物量影响不显著。
利用共聚焦显微镜进一步观察发现，与 WT 相比，Δeap 和 ΔeapΔisaB 生物膜的总体结构和厚度明显减少。对生物膜生物量的定量分析也证实，Δeap 生物膜的厚度显著低于 WT，ΔeapΔisaB 菌株的厚度进一步降低。这些数据表明，Eap 蛋白有助于金黄色葡萄球菌生物膜的总体生物量积累和整体结构形成，而 IsaB 可能影响生物膜结构特性，但不影响生物量积累。
Eap 蛋白降低金黄色葡萄球菌生物膜的孔隙率
为深入研究 Eap 蛋白对金黄色葡萄球菌生物膜结构的影响，研究人员比较了 WT、Δeap 和 ΔeapΔisaB 生物膜的孔隙率。他们使用了三种不同大小的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖（10k、70k 和 150k），让生物膜在 0.45μm 的膜上生长，然后测量每种 FITC - 葡聚糖穿透生物膜的水平。结果发现，在 10k FITC 标记的葡聚糖穿透水平上，各菌株间无差异；但当使用 70k 和 150k FITC 标记的葡聚糖时，缺乏 Eap 蛋白的突变体生物膜孔隙率显著高于 WT。
研究人员还利用在六通道 ibidi 流动池中培养 24 小时的生物膜，对不同大小的 FITC - 葡聚糖的进入和保留情况进行成像。共聚焦图像显示，70k 和 150k（但不是 10k）FITC 标记的葡聚糖在 Δeap 和 ΔeapΔisaB 生物膜中的穿透和保留水平高于 WT 对照。这些数据表明，Eap 蛋白可阻止 70 - 150kDa 颗粒进入，从而降低金黄色葡萄球菌生物膜的总体孔隙率，缺失这三种蛋白会增加生物膜的可及性。
Eap 蛋白减少巨噬细胞对金黄色葡萄球菌生物膜的侵袭和吞噬
此前研究发现 Eap 能保护浮游的金黄色葡萄球菌免受人类中性粒细胞的攻击，本研究进一步探究 Eap 蛋白对先天免疫细胞吞噬生物膜细菌能力的影响。研究人员将成熟的生物膜与原代小鼠骨髓来源的巨噬细胞或中性粒细胞共孵育 4 - 6 小时，以量化白细胞对 WT 或 Δeap 生物膜的侵袭和吞噬数量。结果显示，巨噬细胞对 Δeap 生物膜的侵袭显著增加，含有细菌的巨噬细胞数量也明显增多，且与 Δeap 突变体生物膜相关的可观察到的巨噬细胞总数也显著高于 WT，表明 Eap 蛋白与巨噬细胞对金黄色葡萄球菌生物膜的侵袭和吞噬减少有关。
而用原代小鼠中性粒细胞进行类似实验时，虽然观察到更多中性粒细胞侵入 Δeap 生物膜，但未达到统计学显著性，且在吞噬生物膜细菌的中性粒细胞数量和总中性粒细胞数量上，WT 和 Δeap 生物膜之间无差异。这些结果表明，与中性粒细胞相比，Eap 在防止巨噬细胞吞噬和清除生物膜方面发挥更大作用。
Eap 蛋白在金黄色葡萄球菌人工关节感染中的作用
鉴于缺乏 Eap 蛋白的生物膜在体外更易被巨噬细胞侵袭和吞噬，且结构组织较差，研究人员利用已建立的小鼠人工关节感染模型，比较 WT 和 Δeap 细菌在体内形成生物膜的能力。实验选取了三个时间点，分别反映浮游菌生长（第 3 天）、向生物膜形成的转变（第 7 天）和慢性感染（第 14 天）。结果发现，在感染后第 7 天和第 14 天，Δeap 细菌在感染关节周围组织中的细菌载量显著降低，在第 7 天关节内的细菌载量也明显减少，但在第 14 天未进一步降低。虽然 Δeap 细菌在股骨中的滴度在第 7 天和第 14 天也较低，但未达到统计学显著性，且在植入物上未观察到差异。
研究人员还通过流式细胞术对感染组织样本中的粒细胞髓源性抑制细胞（G - MDSCs）浸润进行定量分析，发现 WT 感染小鼠和 Δeap 感染小鼠的 G - MDSC 浸润相似。虽然 Δeap 感染小鼠在第 7 天的中性粒细胞数量低于 WT，但在第 14 天差异不显著。这些数据表明，Eap 蛋白在体内生物膜相关感染中对促进金黄色葡萄球菌的存活起特定作用，且 Eap 表达可能通过影响巨噬细胞反应，改变免疫反应对细菌存活的影响。
讨论
本研究表明，Eap 蛋白对金黄色葡萄球菌生物膜结构至关重要，并能影响宿主对感染的反应。Eap 蛋白增加生物膜厚度、降低孔隙率，缺失这些蛋白会影响巨噬细胞的抗菌功能，但对生物膜暴露于中性粒细胞时无明显影响。在体内，虽然 Eap 蛋白似乎不改变对金黄色葡萄球菌生物膜感染的先天免疫反应，但 Δeap 细菌的存活率明显低于 WT 细菌，提示 Eap 蛋白可能在体内防止吞噬细胞清除细菌。
近期研究发现 Eap 蛋白具有抑制中性粒细胞衍生的抗菌蛋白酶（如中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶 G）的活性，这可能有助于金黄色葡萄球菌在感染早期逃避中性粒细胞的清除，后续生物膜的形成可能依赖细胞外基质结合伙伴和中性粒细胞靶向毒素的表达。不过，本研究的体内模型存在局限性，生物膜蛋白质组和免疫反应会因组织微环境而异，未来研究需考虑更多生物膜相关感染模型，以及 Eap 蛋白对巨噬细胞抗菌蛋白的影响。
此外，Eap 蛋白具有抗炎和免疫调节作用，可防止酚溶性调节蛋白（PSMs）被中性粒细胞衍生的蛋白酶降解。PSMs 是重要的毒力因子，可裂解中性粒细胞、稳定生物膜结构，但 PSMs 是否有助于 Eap 相关的中性粒细胞耐受性尚待研究。同时，虽然 Eap 蛋白与 DNA 结合并阻断中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成，但金黄色葡萄球菌生物膜可诱导 NETosis 并降解 NETs 中的 DNA，分析 Eap 蛋白对生物膜释放的 NETs 的影响，有助于进一步了解其在中性粒细胞 ET 释放中的作用。
本研究还发现 Eap 蛋白在体外对巨噬细胞有一定保护作用，但这种表型是否仅因生物膜厚度和孔隙率变化导致吞噬细胞更容易进入尚不确定，Eap 对巨噬细胞的直接影响也需进一步研究。此外，生物膜会使巨噬细胞偏向抗炎表型，Eap 在生物膜感染中的抗炎特性可能更相关，而浮游菌感染中其促炎过程可能与生存有关，中性粒细胞在生物膜感染早期可能发挥更重要作用，Eap 可能影响其招募和细胞因子信号传导，未来需更详细地评估体内生物膜形成的时间线。
Eap 在铁饥饿条件下对生物膜形成很重要，且与多种调节网络和生物膜成分相互作用。滑膜液中是否存在 Eap 与其他成分的相互作用尚不清楚，Eap、FnbpA 和 FnbpB 可能在感染不同阶段促进生物膜存活，需要更多研究来明确。鉴于 Eap 在金黄色葡萄球菌菌株中的普遍性，它有望成为感染标记物和治疗靶点。深入了解 Eap 相关的毒力特性，有助于开发针对生物膜感染的单克隆抗体，研究 Eap 与其他生物膜相关因子的相互作用，也有助于探索其在干预金黄色葡萄球菌生物膜感染相关炎症中的应用。本研究丰富了对金黄色葡萄球菌生物膜感染先天免疫反应的认识，为进一步研究 Eap 蛋白在感染中的复杂作用提供了方向。
