靶向 D - 丙氨酰化：对抗耐甲氧西林表皮葡萄球菌感染的新策略

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：D-alanylation of lipoteichoic acids inhibitor provides anti-virulence and anti-resistance effects against methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis

本文发现抑制磷壁酸（TAs）的 D - 丙氨酰化可增强耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）对 β- 内酰胺类抗生素敏感性，为抗感染治疗提供新方向。

　　

引言

在凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）中，表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）是人类皮肤微生物群的主要代表之一。它作为一种共生菌，对维持皮肤内环境稳定和保护皮肤屏障免受包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在内的病原菌侵害有积极作用。然而，近年来多项研究表明，表皮葡萄球菌也是一种新兴的机会致病菌，可引发众多医院获得性感染（HAIs），尤其是与医疗器械和生物膜相关的感染。在美国，2015 - 2019 年的两项研究显示，CoNS 在成人和儿童 HAI 病原体中分别排名第 6 位和第 3 位，其中表皮葡萄球菌导致了 47.4% 和 58.3% 的 CoNS 感染。此外，耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）的流行率不断上升，这类菌株携带含mecA基因的葡萄球菌盒式染色体mec（SSCmec），该基因编码对 β- 内酰胺亲和力低的青霉素结合蛋白（PBP）——PBP - 2a。而且，大多数 MRSE 对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、大环内酯 - 林可酰胺 - 链阳菌素类、四环素类、利福平和复方新诺明等其他类抗生素也具有耐药性，使得这类感染难以用现有批准的抗生素疗法治疗。

面对多重耐药（MDR）细菌的威胁，寻找能恢复抗生素对耐药病原体治疗效果的辅助分子成为一种重要策略。磷壁酸（TAs）的 D - 丙氨酰化修饰是一个极具潜力的靶点。TAs 包括壁磷壁酸（WTAs）和脂磷壁酸（LTAs），是大多数革兰氏阳性菌细胞壁中的阴离子糖聚合物。其负电荷可通过 D - 丙氨酰化机制进行调节，这一过程需要dltXABCD操纵子编码的 5 种必需蛋白参与。此前研究发现，靶向 D - 丙氨酰载体蛋白连接酶 DltA 的抑制剂能增加枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对万古霉素的敏感性，还能使肠球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）对 β- 内酰胺类抗生素敏感，并降低这些病原体的毒力，减少 MRSA 生物膜的形成。在本研究中，科研人员深入探究 DltA 抑制剂对表皮葡萄球菌的作用，旨在为对抗 MDR 革兰氏阳性病原菌寻找新的治疗策略。

材料和方法

1. DltA 蛋白质结构比较：利用 PyMOL 软件中的 “align” 命令，比较枯草芽孢杆菌的 DltA 蛋白（BsuDltA，PDB ID：3E7W，508 个氨基酸）和表皮葡萄球菌的 DltA 蛋白（SeDltA，AlphaFold ID：AF - Q5HQN0 - F1 - v4，485 个氨基酸）的结构，“cycles” 参数设置为 0 - 5。
2. 细菌菌株、培养基和试剂：本研究使用的细菌菌株和质粒信息列于相关表格。表皮葡萄球菌在脑心浸液（BHI）培养基中振荡培养（120 rpm），大肠杆菌（E. coli）根据不同目的在 LB 肉汤或 Terrific 肉汤中振荡培养（120 rpm）。实验所用的抗生素如亚胺培南（IPM）、红霉素（ERY）等分别购自 Sigma - Aldrich 和 VWR 等公司，DltA 抑制剂 {5′ - O - [N - (D - 丙氨酰) - 氨磺酰] - 腺苷} 按文献方法合成，配制成 10 mM 的无菌水溶液备用。
3. 生长动力学、最低抑菌浓度（MIC）测定和细菌存活率：将 BHI 琼脂平板上的菌落悬浮于生理盐水，调整至 OD₆₀₀为 0.5。在含有不同浓度 DltA 抑制剂（0 - 2 mM）的 96 孔微孔板中接种细菌悬液（OD₆₀₀ = 0.02），在 37°C 振荡培养（轨道振幅 3 mm），用酶标仪每 10 min 测量 OD_600nm，持续 24 h，以测定生长动力学。采用 BHI 培养基，按照之前描述的方法测定抗生素的 MIC/MBC 并进行细菌存活率测定，DltA 抑制剂稀释后添加到生长培养基中，终浓度分别为 0、0.1、0.25、0.5、0.75 或 1 mM。
4. 细菌细胞壁中 D - 丙氨酰酯的定量：对之前的方法进行改进来定量酯连接的 D - 丙氨酸。将细菌在含有不同浓度 DltA 抑制剂（0.05 - 1 mM）的 5 mL BHI 培养基中，37°C 振荡培养（120 rpm）16 h。该定量方法基于 D - 氨基酸氧化酶氧化游离 D - 丙氨酸产生 H₂O₂，H₂O₂再氧化显色剂的原理，进行 3 次独立实验，每个样本设置 2 个重复。
5. 大蜡螟（G. mellonella）感染模型和宿主内抗生素 / 抑制剂联合疗效：按照之前的方法，使用大蜡螟幼虫进行毒力和治疗效果实验。将表皮葡萄球菌菌株在 BHI 肉汤中培养，调整感染剂量约为 5×10⁶ CFU / 幼虫。感染 2 h 后，注射亚胺培南（0.6 mg/kg）和不同剂量的 DltA 抑制剂（24.2、36.4 或 48.5 mg/kg）。通过平板计数法检查细菌接种量，对于定植实验，幼虫感染约 10³ CFU 的 MRSE 11，处理方式相同，在感染后 0 和 24 h 通过平板培养测定宿主体内细菌载量，利用含 75 μg/mL 红霉素的 BHI 琼脂平板区分 MRSE 11 和共生菌群。
6. 生物膜抑制和清除：对已有方法进行改进来进行生物膜抑制（BI）和清除（BE）实验。生物膜经结晶紫染色后不再进行第二次风干，用酶标仪在 570 nm 处测定吸光度。为计数生物膜内的活菌，采用与 BE 实验相同的步骤，但在室温下用 40 kHz 的超声处理器处理微孔板 5 min，而非染色，然后将分散的生物膜在 BHI 琼脂平板上进行菌落计数。
7. DltA 和 DltC 过表达质粒的构建：本研究使用的引物列于相关表格。采用 Q5 聚合酶进行 PCR 反应，通过 Mastercycler Nexus gradient 热循环仪实现热程序。按照试剂盒说明提取表皮葡萄球菌 MRSE 26 的染色体 DNA，分别用特定引物对扩增dltA和dltC基因，同时扩增表达载体 pET29b (+)。用DpnI 处理去除剩余的环状拷贝，将基因扩增产物和线性化载体转化到大肠杆菌 BL21 中进行体内同源重组。
8. 化学感受态细胞的制备和转化：本研究使用的缓冲液列于相关表格。将大肠杆菌 BL21 过夜培养后稀释，当 OD₆₀₀达到 0.5 时，离心收集菌体，重悬于 TSS 缓冲液中， - 80°C 保存。使用时，取适量感受态细胞在冰上解冻，加入 KCM 5X 缓冲液。将线性化的 pET29b (+) 和基因扩增产物按 6:4 的比例混合后加入感受态细胞，依次在 4°C 孵育 30 min、42°C 孵育 45 s，再加入 LB 肉汤，37°C 孵育 1 h。复苏后，将细胞涂布在含 25 μg/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板上，通过菌落 PCR 扩增检测转化和体内重组情况。
9. DltA 和 DltC 的过表达和纯化：在带挡板的锥形瓶中，用携带过表达载体的大肠杆菌 BL21 过夜培养物接种 250 mL Terrific 肉汤（起始 OD₆₀₀ = 0.1），37°C 振荡培养（160 rpm）至 OD₆₀₀达到 0.5，加入终浓度为 0.5 mM 的 IPTG，继续振荡培养 3 h。收集培养物，用纯化缓冲液洗涤，离心后将沉淀重悬于含 1 mg/mL 溶菌酶的缓冲液中，4°C 孵育 30 min，然后超声破碎。通过 HisTrap FF Crude 柱在 ?KTA Start 系统上进行纯化，依次用含 50 mM 咪唑的缓冲液洗脱杂质，再用 60 - 500 mM 咪唑梯度洗脱目的蛋白。将目的蛋白收集到 Vivaspin Turbo RC 50 kDa MWCO 柱中浓缩，再用 PD - 10 柱脱盐，最后用 Vivaspin 30 kDa MWCO 柱再次浓缩， - 80°C 保存。通过 12.5% 聚丙烯酰胺 SDS - PAGE 凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检查纯化效果，并用 MS/MS 测序验证纯化的 DltA 和 DltC 蛋白。
10. 半最大抑制浓度（IC₅₀）的测定：通过监测 PPi 释放，采用偶联酶法测定 DltA 催化的 ATP 水解反应（DltA + D - 丙氨酸 + ATP → DltA - DAla - AMP + PPi）。将纯化的 DltA 用从大肠杆菌纯化的 DltC 预处理，去除表达过程中产生的 D - Ala - AMP。预处理后的 DltA 与 ATP、D - 丙氨酸等反应体系成分混合，加入不同浓度的合成分子测定潜在 DltA 抑制剂的 IC₅₀。PPi 释放量用 PiPer - 焦磷酸盐检测试剂盒测定，反应在 96 孔板中进行，37°C 孵育 5 h，用 FlexStation 3 多功能酶标仪检测，激发波长 530 nm，发射波长 590 nm，实验重复 6 次，通过曲线线性回归确定 IC₅₀。

结果

1. 枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的 DltA 蛋白结构高度相似：枯草芽孢杆菌的BsuDltA 蛋白由两个亚基组成，通过柔性铰链环连接，底物结合后可发生构象变化，催化 D - 丙氨酸的腺苷化和转移。本研究使用的 DltA 抑制剂是 D - 丙氨酰腺苷酸反应中间体的非水解类似物，被认为是竞争性抑制剂。比较BsuDltA 和SeDltA 的结构发现，根据不同的优化循环次数，两者结构叠加的均方根偏差（RMSD）在 2.22 ?（480 个氨基酸对齐）到 0.718 ?（377 个氨基酸对齐）之间，表明总体结构保守。底物和 D - 丙氨酸特异性口袋结构完全同源，P 环和铰链区域虽各有一个氨基酸差异，但整体三维结构仍保持保守。
2. DltA 抑制剂在体外靶向表皮葡萄球菌的 DltA 蛋白：在大肠杆菌中异源表达并纯化表皮葡萄球菌的 DltA 蛋白，利用renz R 包测定其 K_m和 V_max，分别为 5.43 ± 2.03 μM 和 279 ± 17.22 RFU?h^?1，与已报道的其他细菌的 K_m值处于同一数量级。由于之前描述的 DltA 抑制剂干扰测量 DltA 活性的偶联酶法，无法测定 K_i，但通过偶联酶法测定了 IC₅₀，结果为 2.43 ± 0.33（均值 ± 标准差）μM，表明该抑制剂在体外对表皮葡萄球菌的 DltA 蛋白具有良好的亲和力。
3. DltA 抑制剂降低 β- 内酰胺类抗生素对 MRSE 的 MIC：为寻找能使 MRSE 对 β- 内酰胺类抗生素重新敏感的联合治疗方案，测定了 24 株 MRSE 临床分离株在有无 1 mM DltA 抑制剂存在下，对氧氟沙星（OXA）、头孢西丁（FOX）和亚胺培南（IPM）的 MIC。这些菌株对测试的 β- 内酰胺类抗生素表现出不同的耐药谱，MIC 范围分别为：IPM 4 - 128 μg/mL，FOX 16 - 512 μg/mL，OXA <2 - 512 μg/mL。总体而言，DltA 抑制剂显著降低了大多数 MRSE 分离株对 OXA 和 IPM 的 MIC。对于 OXA，87.5% 的测试菌株 MIC 降低 8 倍，但仍高于 CLSI 2020 年推荐的敏感阈值（≤0.25 μg/mL）；对于 FOX，在抑制剂存在下，71.4% 的可测定 MIC 的菌株（共 7 株）MIC 降低 4 倍；对于 IPM，83.3% 的测试菌株 MIC 降低 8 - 256 倍，且所有菌株在抑制剂作用下对亚胺培南重新敏感，符合 CLSI 2010 年的推荐标准。不过，有 4 株菌株对 IPM/DltA 抑制剂联合治疗耐药。进一步研究发现，0.5 mM 的 DltA 抑制剂是显著降低 3 株菌株 IPM MIC 的最小浓度，但要使表皮葡萄球菌对 IPM 的敏感性低于其敏感阈值，仍需 1 mM 的抑制剂。综合 MBC 测量结果，IPM / 抑制剂联合治疗对大多数测试菌株具有抑菌作用。
4. DltA 抑制剂降低表皮葡萄球菌细胞壁的 D - 丙氨酰化水平：为验证抑制剂在体内是否阻断 D - 丙氨酰化，测定了 MRSE 6、MRSE 11 和 MRSE 20 菌株在不同浓度 DltA 抑制剂存在下细胞壁 D - 丙氨酰残基的含量。结果显示，抑制剂以剂量依赖的方式抑制细胞壁 D - 丙氨酰化。在 0.25 mM 时，MRSE 11、MRSE 6 和 MRSE 20 的 D - 丙氨酰化水平分别降低 42%、20% 和 11.5%，这种抑制作用与抑制剂浓度增加时对 IPM 敏感性的提高密切相关。在 1 mM 时，所有测试菌株的抑制率接近 100%。
5. DltA 抑制剂提高感染 MRSE 的大蜡螟存活率：在大蜡螟感染 MRSE 模型中，用致死剂量的 MRSE 11 或 MRSE 20 感染幼虫，感染 2 h 后分别注射生理盐水、IPM（0.6 mg/kg）、DltA 抑制剂（48.5 mg/kg）或 IPM/DltA 抑制剂组合。结果显示，单独使用 IPM 对幼虫存活率无影响，而单独使用 DltA 抑制剂可显著提高感染 MRSE 11 或 MRSE 20 幼虫的存活率，分别在感染 36 h 后提高 30% 和 35%。定植实验表明，这并非由于抑制剂对细菌在宿主体内生长的抑制作用。对于对所有 β- 内酰胺 / DltA 抑制剂组合耐药的 MRSE 10 菌株，感染幼虫后用不同剂量 DltA 抑制剂处理，结果显示幼虫存活率随抑制剂剂量增加而升高，最高剂量时提高了 30%。然而，IPM/DltA 抑制剂联合治疗与单独使用抑制剂相比，对 MRSE 20 和 MRSE 11 感染的大蜡螟存活率改善不明显。
6. DltA 抑制剂 / IPM 联合治疗影响表皮葡萄球菌生物膜形成：表皮葡萄球菌在医疗器械和生物表面形成生物膜是临床治疗的难题。以生物膜形成能力较强的 MRSE 11 为研究对象，单独使用 DltA 抑制剂未降低生物膜形成，但使其四分位间距增加 4 倍，可能反映出生物膜在洗涤过程中变得更脆弱。单独使用 IPM 时，较高的亚 MIC 浓度会轻微增加生物膜形成。而 DltA 抑制剂（0.5 mM）与不同浓度 IPM 联合使用时，OD₆₀₀比单独使用 IPM 时降低至少 70%。虽然即使在 1 mM DltA 抑制剂存在下也未观察到生物膜完全清除，但与低剂量 IPM（0.25 - 8 μg/mL）联合使用时，生物膜内细菌存活率降低约 1 log。

讨论

革兰氏阳性菌中，由dltXABCD操纵子编码的 5 种蛋白介导的 TAs 的 D - 丙氨酰化是一个有前景的新型药物靶点。虽然 D - 丙氨酰化并非细菌生存所必需，但缺乏该修饰会降低细菌毒力、生物膜形成能力和对抗菌药物的耐药性。此前研究已证实 TAs 的 D - 丙氨酰化抑制剂对肠球菌和 MRSA 的抗生素耐药性有抑制作用。鉴于表皮葡萄球菌已成为 HAIs 的主要致病菌之一，本研究探讨了相同 DltA 抑制剂对该菌的作用。通过比较SeDltA 和BsuDltA 的结构，虽发现两个氨基酸差异，但位于不与 D - 丙氨酰腺苷酸中间体相互作用的区域，因此推断 DltA 抑制剂对SeDltA 应具有活性，实验测得的 IC₅₀值也证实了这一点。

在联合治疗实验中，β- 内酰胺类抗生素与 DltA 抑制剂的组合降低了大多数测试 MRSE 临床分离株的<