探秘 3D 细胞培养：关键变量如何重塑球体模型

《Scientific Reports》：Influence of experimental variables on spheroid attributes

研究人员分析 32,000 张球体图像，探究影响 3D 模型可靠性的参数，为标准化 3D 培养提供指南。

　　在生物医学研究的领域中，细胞培养就像是搭建生命科学大厦的基石。传统的二维（2D）单层细胞培养，就像把细胞养在 “平地上”，虽然在基础细胞生物学研究中发挥了重要作用，但它无法重现体内复杂的微环境，比如空间结构、生化梯度以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用。这就好比在一个简单的舞台上表演，无法展现出真实世界的丰富剧情。这种局限性使得临床转化困难重重，例如化疗药物在 2D 模型和患者来源的 3D 肿瘤系统中，半数抑制浓度（IC₅₀）值可能相差 10 倍以上，导致超过 90% 的肿瘤药物在临床试验中失败，即便它们在 2D 临床前数据中表现良好。

为了解决这些问题，三维（3D）细胞培养系统应运而生，球体模型便是其中的代表。它就像为细胞打造了一个更接近真实体内环境的 “小世界”，能够模拟组织特有的营养梯度、区域化（如坏死核心和增殖外周）以及多细胞间的相互作用，在药物筛选等方面展现出了强大的预测能力。然而，由于实验方案的可变性，尤其是培养基成分（如葡萄糖、钙）、氧张力和操作人员依赖的方法不同，导致球体的形态和行为不一致，这大大限制了 3D 培养系统的广泛应用，就像在建造一座大厦时，没有统一的标准，每一层都可能出现差异。

为了攻克这一难题，广东医科大学附属东莞第一医院广东省医学免疫学与分子诊断重点实验室、东莞分子免疫学与细胞治疗重点实验室等研究机构的研究人员 Songshan Zhu、Jun Yin 等人开展了一项深入研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞培养方面，选用了 Jurkat T、HCT 116、HEK 293T、MCF-7 等多种细胞系，并通过严格的细胞系验证和支原体污染检测，确保实验的准确性。利用单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术，分析细胞的基因表达情况，了解细胞在不同条件下的状态。借助自动化图像分析软件 AnaSP v2.1 和 ReViSP v2.2，对 32,000 张球体图像进行处理和分析，获取球体的各项指标，如紧凑度、等效直径、最大 Feret 直径、周长、固体度、球形度和体积等。还运用了流式细胞术、ATP 检测等实验技术，对细胞的相关指标进行量化分析。

研究结果如下：

• 培养时间对球体景观的影响：对 MCF-7 球体进行 19 天的培养，发现随着时间推移，球体尺寸逐渐增大，但内部结构完整性和活力却逐渐下降。scRNA-seq 分析显示，不同时间点的球体存在两个具有分化阶段特异性基因表达的 MCF-7 亚群，且 19 天球体中与 ECM 相关的基因（如 COL18A1、MUC5B 和 PIEZO1）表达上调，基因富集和基因 - 基因相互作用也存在显著的时间差异。
• 不同培养基对球体的影响：分析常见培养基发现，其成分与血浆差异较大，如葡萄糖和钙的浓度与血浆不同。研究 HEK 293T 球体在不同培养基中的生长动力学和活力，结果表明不同培养基对球体的大小、规则性、死亡信号和细胞活力有显著影响。例如，RPMI 1640 培养基培养的球体死亡信号强度更高，DMEM/F12 培养基中球体的活力最低。
• 血清浓度决定球体结构：研究发现 MCF-7 球体的生长动力学依赖胎牛血清（FBS）浓度。较高的血清浓度可增强球体的规则性、密度和大小，提高细胞活力；血清浓度为 10% - 20% 时，球体结构最佳，能形成明显的坏死、静止和增殖区域；而血清浓度较低时，球体会缩小，密度降低，细胞脱落增加。
• 氧气对球体景观的影响：氧气浓度对球体微环境影响重大。在 3% O₂条件下，球体尺寸减小，细胞活力和 ATP 含量降低，坏死区域的 PI 信号增强。在与 Jurkat T 细胞的共培养实验中，3% O₂条件下 T 细胞的死亡减少，推测低氧共培养微环境可能有利于 Jurkat T 细胞的存活。
• 初始接种细胞数量对球体景观的影响：初始接种细胞数量显著影响球体大小。不同细胞类型的球体在不同接种细胞数量下生长动力学不同，如 MCF-7 细胞形成的球体随时间减小，HCT 116 细胞形成的球体则相反。接种细胞数量为 6000 - 7000 时，部分球体会出现结构不稳定甚至破裂的情况，但部分球体在培养 6 天后具有自我修复能力。

研究结论和讨论部分指出，球体形成分为三个阶段，成熟球体具有坏死核心、静止活细胞区域和外层增殖层的结构。随着球体增大，内部可能会出现缺氧和营养缺乏的情况，导致细胞活力下降。实验变量如 FBS 浓度、氧气水平、培养基成分和初始细胞密度对球体的形成、生长和细胞行为至关重要，但这些因素常被研究人员忽视。优化培养基成分以更接近生理条件，精确控制血清浓度、氧气水平和初始细胞密度，对于建立可靠的 3D 球体模型至关重要。该研究为标准化 3D 细胞培养系统提供了详细的、可转移的方案和可行的指导方针，有助于提高实验的可重复性，推动 3D 培养系统在药物筛选、个性化医疗和肿瘤生物学等领域的广泛应用，为加速 3D 培养系统在肿瘤学和再生医学中的临床应用奠定了坚实基础。