优化单链寡脱氧核苷酸，提升人类细胞基因组编辑效率

《Scientific Reports》：Efficiency of genome editing using modified single-stranded oligodeoxyribonucleotides in human cells

研究人员为提升 ssODN 基因编辑效率，研究 LNA 修饰及链长影响，发现优化方法且该法对碱基替换有效。

　　在生物技术蓬勃发展的当下，基因组编辑就像一把神奇的 “基因剪刀”，能精准地修改生物的遗传密码，在高效生物质生产和疾病治疗等领域发挥着关键作用。其中，CRISPR-Cas 系统凭借操作简便的优势，成为目前应用最广泛的基因组编辑技术。它就像一位 “基因导航员”，通过引导 RNA（gRNA）识别目标序列，再借助细菌来源的核酸酶 Cas9，轻松实现对目标基因的编辑。

然而，这把 “剪刀” 并非完美无缺。在实际应用中，CRISPR-Cas 系统面临着诸多挑战。比如，为了实现精准编辑，需要引入额外的核酸来促进目标位点的同源重组，但这一过程并不容易把控；它还存在脱靶编辑的风险，就像射箭时射偏了靶子，可能会错误地影响到非目标序列；而且，源自外源生物的 Cas 蛋白可能会触发机体的免疫反应，给应用带来潜在风险。这些问题严重限制了其在对精准度要求极高的医学领域的应用。

相比之下，单链寡脱氧核苷酸（ssODN）方法则展现出独特的优势。它不需要引入 Cas 蛋白，就能实现对目标序列的精准修饰，极大地降低了脱靶效应和免疫反应的风险，就像是一位悄无声息的 “基因微调师”，在不引起过多 “波澜” 的情况下，精准地调整基因。不过，ssODN 也有自己的短板 —— 编辑效率较低，这就好比一辆性能不错但速度较慢的汽车，限制了它在实际治疗中的广泛应用。

为了攻克这一难题，来自日本国立先进工业科学技术研究院生物医学研究所、德岛大学先进医学科学研究所等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为提升 ssODN 的基因组编辑效率带来了新的希望。

研究人员主要采用了细胞实验、基因编辑技术、核酸测序技术等关键方法。在细胞实验方面，培养了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告细胞；基因编辑实验中，设计并使用多种不同长度和 LNA 修饰的 ssODN 对细胞进行转染；通过核酸测序技术，如深度测序（NGS）来分析基因组编辑效率。

研究人员首先探究了基于天然 DNA 长度的基因组编辑效率。他们构建了含有 8 个外源碱基的失活 EGFP 盒的人类细胞（HEK293T），这些额外的碱基就像是混入基因序列中的 “捣乱分子”，让 EGFP 无法正常发挥作用。然后，研究人员设计了 20 - 100 nt 不同长度的 ssODNs，这些 ssODNs 就像是 “基因修复小能手”，旨在去除这 8 个捣乱的碱基，恢复 EGFP 的正常功能。通过转染实验和深度测序分析发现，随着转染的 ssODNs 长度增加，8 碱基缺失的基因组编辑效率逐渐提高。例如，20 nt 的 ssODN 编辑效率不足 0.0001%，而 100 nt 时达到了 0.0154%。同时，流式细胞术分析也表明，随着 ssODNs 长度增加，表达 EGFP 荧光的细胞数量增多，不过该方法检测的效率始终低于 NGS。这一系列实验表明，虽然效率不算高，但通过引入 ssODNs 确实可以实现位点特异性编辑，而且增加 ssODN 长度有助于提升编辑效率。

接着，研究人员研究了引入 LNA 的数量对基因组编辑效率的影响。锁定核酸（LNA）是一种特殊的核酸修饰工具，它就像是给核酸加上了 “强力胶水”，能增强与 DNA 和 RNA 的结合亲和力。研究人员在 80 nt 的 ssODNs 两端引入不同数量的 LNA，分别构建了含有 10（80 - 10L）、12（80 - 12L）和 14（80 - 14L）个 LNA 的 ssODNs。实验结果令人惊喜，80 - 10L 的编辑效率比相同长度的天然 DNA 高 1.23 倍，80 - 12L 高 1.5 倍，80 - 14L 更是比 80 nt 天然 DNA 的编辑效率提高了 3.77 倍。这充分说明，在 80 nt 的 ssODN 两端引入 10 个以上的 LNA，随着 LNA 数量的增加，基因组编辑效率显著提升。

随后，研究人员又聚焦于 LNA 引入位置对基因组编辑效率的影响。他们发现，LNA 的引入位置对编辑效率影响很大。以 80 - 14L 为基础，改变最内层 LNA 的位置构建多个 ssODNs 进行实验。结果显示，当在距离 ssODN 中心 25 nt（80 - 12L - 50c2L）和 20 nt（80 - 12L - 40c2L）处引入 LNA 时，编辑效率大幅提高，是 80 - 12L 的两倍多，几乎与 80 - 14L 相当；而在距离中心 15 nt（80 - 12L - 30c2L）和 10 nt（80 - 12L - 20c2L）处引入 LNA，编辑效率反而低于相同长度的天然 DNA。这表明，引入 LNA 的位置至关重要，不合适的位置会阻碍基因组编辑。进一步研究不同长度含 10 个末端 LNA 的 ssODNs 发现，60 - 10L、70 - 10L 和 80 - 10L 的编辑效率高于相应天然 DNA，其中 70 - 10L 效果最为显著，比相同长度的天然 DNA（DNA - 70）高 8.5 倍，这是因为其 LNA 引入位置在 25 - 35 nt，与之前编辑效率提升的区域部分重叠。由此可见，选择合适长度的 ssODN 并考虑 LNA 引入位置，对提高编辑效率至关重要。

为了找到最有效的基因组编辑 ssODN，研究人员以编辑效率最高的 70 - 10L 为标准进行了一系列实验。在 80 nt 的 ssODN 中，在与 70 - 10L 相同位置添加 LNA，结果 70 - 10L - 40c2L 的编辑效率相比 70 - 10L 几乎翻倍，这表明在距离 ssODN 中心 20 - 35 nt 的位置，适当间隔引入足够数量的 LNA（如在 25 - 35 nt 处引入五对，20 - 25 nt 处引入一对）对高效基因组编辑很重要。去除 70 - 10L - 40c2L 最外层和最内层的 LNA 后，编辑效率大幅下降，再次证明了中心 25 - 35 nt 区域的 LNA 与 20 nt 处 LNA 协同维持高效编辑的重要性。此外，给 70 - 10L - 40c2L 两端添加 10 nt 天然 DNA 得到 90 - 70type - 10L - 40c2L，虽末端无 LNA 修饰，但编辑效率比 70 - 10L - 40c2L 高 1.5 倍，说明在该方法中，特定位置的 LNA 比末端 LNA 对编辑效率更重要。

在实际治疗中，往往需要精准替换致病基因突变。研究人员利用之前实验中编辑效率高的 ssODNs，对 “80stop EGFP 细胞” 进行单核苷酸替换实验。结果显示，70 - 10L、70 - 10L - 40c2L 和 90 - 70type - 10L - 40c2L 的碱基替换效率分别是 DNA - 80 的 173.48 倍、240.01 倍和 280.92 倍，且通过 NGS 确认其碱基替换效率分别超过 0.42%、0.52% 和 0.63%，这表明引入 LNA 的 ssODNs 在碱基替换方面效率很高，证明了 ssODNs 在单核苷酸替换的基因组编辑中是一种优秀的方法。

总的来说，这项研究通过优化 ssODN 的长度和 LNA 插入位置，显著提高了基因组编辑效率，并且证实了该方法在碱基替换方面的高效性。这一成果为基因组编辑技术的发展提供了重要的理论依据和实践指导，有望推动基于 ssODN 的基因组编辑在个性化医学和基因组治疗领域的应用。尽管目前距离实际应用还有一些问题需要解决，如疾病相关基因组区域结构复杂多样等，但随着研究的不断深入，相信这些问题将逐步得到解决，让基因组编辑更好地造福人类健康。