新型抗体模拟物 Nanofitin-IRDye800CW 用于 HER-2 阳性肿瘤无创诊断的全方位突破

《Scientific Reports》：Complete preclinical evaluation of the novel antibody mimetic Nanofitin-IRDye800CW for diverse non-invasive diagnostic applications in the management of HER-2 positive tumors

为解决 HER-2 表达非侵入性检测难题，研究人员研发 NF-800，其特异性强、靶向效果好，有望用于肿瘤诊断等。

　　在癌症治疗的 “战场” 上，精准打击肿瘤是关键。HER-2（人表皮生长因子受体 2）作为肿瘤治疗的重要 “靶点”，在许多癌症中都过度表达，就像给癌细胞披上了 “强化铠甲” ，让它们肆意增殖、侵袭。准确检测 HER-2 的表达状态，对判断病情和制定治疗方案至关重要。目前，用于检测 HER-2 状态的标准方法，如免疫组化（IHC）和荧光原位杂交（FISH），就像一把双刃剑，虽然有一定作用，但却需要进行侵入性操作，给患者带来痛苦和风险。而且，由于肿瘤中 HER-2 表达存在时空异质性，这些方法很难实时、全面地反映 HER-2 的真实状态，就好比在迷雾中寻找目标，容易出现偏差，导致治疗决策失误。

为了打破这种困境，来自意大利 Bracco Research Centre、法国 Affilogic SAS 等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们致力于研发一种新型的诊断工具，期望能够实现 HER-2 相关肿瘤的非侵入性检测，为癌症诊断和治疗开辟新的道路。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》杂志上。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。在筛选和制备方面，通过核糖体展示技术从文库中筛选出对 HER-2 具有高特异性和亲和力的纳米适配体（Nanofitin），并进行改造和大量制备。在检测分析时，利用生物膜干涉技术（BLI）测定结合动力学，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）评估结合能力、稳定性等，借助流式细胞术分析结合亲和力、竞争结合以及细胞摄取情况，还通过体内光学成像（OI）技术在多种肿瘤模型中研究生物分布和肿瘤靶向效果。

研究结果令人振奋。首先是纳米适配体 NF 的发现与鉴定。研究人员通过多轮核糖体展示筛选，从众多候选物中找到了 NF。它就像一把精准的 “钥匙”，能有效内化并将 Pe₃₈毒素传递到 HER-2 高表达的 SK-BR-3 细胞内，半数有效浓度（EC₅₀）为 0.83 nM，而无关纳米适配体则无法做到。之后对 NF 进行改造，引入 C 末端半胱氨酸（NF-Cys），这一改造不仅实现了与荧光团的特异性结合，还提高了其与 HER-2 的亲和力，解离常数（K_D）从 58.0 nM 提升到 0.9 nM。

在纳米适配体的生产与功能评估环节，研究人员在大肠杆菌中诱导表达纳米适配体，经过多步纯化后，得到了纯度大于 95% 的产品。ELISA 检测显示，其功能良好，结合常数（K_D）在个位数纳摩尔范围，与 IRDye800CW 偶联后（NF-800），仍保持双位数纳摩尔范围的亲和力。而且，NF-Cys 在不同储存条件下稳定性良好，在 2 - 8°C 储存时亲和力更佳。

NF-800 对细胞表面 HER-2 的亲和力和细胞内化能力也表现出色。在高表达 HER-2 的 BT-474 和 OE-19 细胞系中，NF-800 的亲和力（K_D）分别为 53 ± 15 nM 和 112 ± 12.3 nM 。在细胞内化实验中，NF-800 能有效区分高表达和低表达 HER-2 的细胞，在 OE-19 细胞中的内化率高达 90%，远远超过未偶联的染料 IRDye800CW。

在体外竞争结合实验中，无论是通过 ELISA 还是在 OE-19 细胞上进行的实验都表明，NF-Cys 与曲妥珠单抗（Trastuzumab，Tz）和帕妥珠单抗（Pertuzumab，Pz）的结合位点不同。即使在大量 Tz 或 Pz 存在的情况下，NF-800 与 HER-2 的结合也不受影响。

体内研究进一步验证了 NF-800 的优势。在 BT-474 异种移植瘤模型中，注射后 6 小时，NF-800 在肿瘤中的定位就明显高于肌肉组织，肿瘤与背景的比值（TBR）达到 2.09 ± 0.66，并且在 48 小时内保持稳定。随着时间推移，肾脏中的荧光信号显著增强，表明其主要通过肾脏排泄。与 HER-2 低表达的肿瘤模型（MCF-7 和 HT-29）相比，NF-800 在 HER-2 高表达的 BT-474 肿瘤中的积累量明显更高。在 OE-19 异种移植瘤和原位瘤模型中，NF-800 的荧光对比度更高，TBR 值显著高于 BT-474 肿瘤。与曲妥珠单抗偶联物（Tz-800）相比，NF-800 在早期时间点的肿瘤靶向效果更优。在患者来源的异种移植（PDX）模型中，NF-800 同样表现出色，48 小时时的 TBR 值为 3.3 ± 0.7，高于 Tz-800 在 7 天时的 TBR 值（2.4 ± 0.1）。

研究结论和讨论部分指出，NF-800 作为一种专门为光学成像（OI）应用设计的新型靶向剂，具有诸多优势。它能够快速排泄，在非排泄器官中信号低，减少对正常组织的潜在危害；同时，能特异性地靶向 HER-2 表达的肿瘤，在肿瘤中呈现高荧光信号，实现快速肿瘤靶向。而且，由于它与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的结合位点不同，这为其与这些标准治疗抗体联合使用开辟了新的可能性，可用于监测患者对治疗的早期反应，还能应用于荧光引导手术（FGS），帮助医生更精准地切除肿瘤，评估淋巴结受累情况。此外，纳米适配体的生产和纯化具有良好的可扩展性，为其未来的临床应用奠定了坚实基础。这项研究成果为 HER-2 相关肿瘤的非侵入性检测、患者分层、治疗效果监测以及图像引导手术等提供了新的有力工具，为癌症治疗领域带来了新的希望，有望推动癌症诊疗技术的进一步发展。