增殖性玻璃体视网膜病变小鼠模型：RPE 细胞的关键作用及研究新突破

《Scientific Reports》：Involvement of tdTomato-Tagged RPE cells in a mouse PVR model with enzymatically compromised retina

研究人员为明确视网膜色素上皮（RPE）细胞在增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）中的作用，构建小鼠模型，发现其分子特征与人类相似，为相关研究提供新方向。

　　增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）是一种令人头疼的眼部疾病，它常发生在大约 5 - 10% 的视网膜脱离病例中，是导致视网膜脱离手术失败的 “罪魁祸首”，会引起视网膜反复脱离，让患者视力严重受损甚至失明。然而，目前人们对 PVR 的发病机制了解并不透彻。大家都知道，PVR 的发生往往和眼部受到创伤、进行手术有关，可这些损伤究竟是如何一步步引发 PVR 的，却不清楚。在 PVR 发病过程中，视网膜上会形成纤维组织，就像一层 “捣乱” 的膜，不断收缩，牵拉视网膜，造成脱离。而这层膜的形成涉及多种细胞，其中视网膜色素上皮（RPE）细胞被认为是关键 “嫌疑人”，但它具体是怎么参与其中的，还存在很多疑问。而且现有的 PVR 动物模型，要么是往动物眼睛里植入外源细胞，这和人类 PVR 的真实发病过程相差甚远；要么模型构建方法存在各种缺陷，没办法很好地模拟人类疾病。所以，为了搞清楚 PVR 的发病机制，开发更有效的治疗方法，研究人员迫切需要一个可靠的动物模型。

美国路易斯维尔大学医学院的研究人员勇挑重担，开展了一项意义重大的研究。他们利用 dispase 处理损伤视网膜，成功构建了 RPE 标记的 PVR 小鼠模型。通过一系列实验，研究人员发现，在这个小鼠模型中，RPE 细胞会从原本的位置脱离，穿过视网膜，在视网膜表面形成类似 PVR 的膜。而且，这些 RPE 细胞在这个过程中发生了上皮 - 间质转化（EMT），获得了成肌纤维细胞的特性。更重要的是，研究人员通过基因表达谱分析发现，小鼠 PVR 模型视网膜的基因表达谱和人类 PVR 视网膜的基因表达谱非常相似。这意味着这个小鼠模型不仅在组织学和细胞层面，而且在分子层面都能很好地模拟人类 PVR，为深入研究 PVR 的分子机制和开发新的治疗药物提供了有力工具。该研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员在开展这项研究时，用到了几种主要关键技术方法。首先是构建 RPE 标记小鼠，通过将 CAG-STOP^f/f-tdTomato 小鼠与 BEST1-Cre 小鼠杂交，获得能稳定表达红色荧光蛋白 tdTomato 的 RPE 谱系示踪小鼠，方便追踪 RPE 细胞。其次是建立小鼠 PVR 模型，给 8 周龄小鼠玻璃体腔内注射 dispase，或用钝针刮擦视网膜，或两种方法结合来诱导 PVR。然后是利用免疫组化技术，检测细胞标记物，判断细胞类型和状态。还有通过 RNA 提取和实时定量 PCR、微阵列分析，研究基因表达变化情况 。

下面来看具体的研究结果：

1. RPE 细胞参与 PVR 发展：研究人员收集了 14 例患者的视网膜前膜（ERM）样本，发现多数样本有色素沉着，且含有 RPE65 阳性细胞，同时也有少量 GS 阳性或 GFAP 阳性细胞。这表明 RPE 细胞参与了 PVR 患者 ERM 的形成。进一步对 ERM 样本进行 qPCR 分析，发现与正常 RPE 组织相比，ERM 中的 RPE 细胞失去了一些上皮细胞特性相关基因的表达，如 EGF、CDH1 和 DCT，同时获得了间充质细胞特性相关基因的表达，如 FGF、CDH2 和 COL1A2，还重新获得了增殖能力，这一系列分子变化都表明 RPE 细胞发生了 EMT，推动了 PVR 的发展。
2. 建立小鼠 PVR 模型：研究人员尝试了多种方法诱导小鼠产生 PVR 样表型。结果发现，给 C57BL/6 小鼠玻璃体腔内注射 0.6U/mL dispase，7 周后 100% 的小鼠出现 PVR 样表型；而单独对视网膜进行 “按摩” 处理，却没有诱导出 PVR。将 dispase 处理和视网膜 “按摩” 相结合，反而对 PVR 的诱导产生了负面影响。在 BALB/c 小鼠中进行同样的实验，也得到了类似的结果，这证明 dispase 处理能有效诱导小鼠产生 PVR 样表型，而 “按摩” 则没有积极作用，甚至有负面效果。此外，研究人员还发现，给小鼠注射 dasatinib（一种 ATP 竞争性蛋白酪氨酸激酶抑制剂），可以抑制 dispase 诱导的小鼠 PVR 样表型发展。
3. RPE 谱系示踪小鼠的特性：通过杂交获得的 RPE 谱系示踪 CAG-tdTomato 小鼠，其 RPE 细胞在体内和体外都能稳定表达红色荧光蛋白 tdTomato。在体外培养过程中，虽然 RPE 细胞随着传代发生了 EMT，形态从有色素的上皮细胞变成了无色素的成纤维细胞样细胞，但红色荧光依然持续存在，这说明该小鼠模型是稳定且可行的，能用于追踪 RPE 细胞。
4. RPE 细胞的迁移和变化：对注射 dispase 后的小鼠眼睛进行观察，发现 RPE 细胞从 RPE 层脱离，部分重新附着在视网膜外侧形成单细胞膜，还有部分穿过神经视网膜形成视网膜内带。当这些 RPE 细胞附着在视网膜表面时，开始表达成肌纤维细胞标记物 SMAα，这表明它们可能发生了 EMT，获得了成肌纤维细胞的特性。
5. 小鼠 PVR 模型与人类 PVR 的相似性：研究人员对比了人类 PVR 视网膜和正常视网膜的基因表达谱，发现 PVR 视网膜中 RPE、神经视网膜、血管内皮等相关基因表达下调，而细胞迁移和免疫细胞浸润相关基因表达上调。对小鼠 PVR 模型视网膜进行 qPCR 分析，得到了与人类相似的基因表达模式，这进一步证实了小鼠 PVR 模型在分子层面与人类 PVR 视网膜相似。

在研究结论和讨论部分，该小鼠 PVR 模型在多个层面与人类 PVR 相似，是研究 PVR 分子机制和开发药物的理想模型。不过，这个模型也有局限性，比如无法追踪细胞外基质（ECM）的来源。而且，虽然研究发现 RPE 细胞在 PVR 中发生了迁移和 EMT，但具体是什么触发 RPE 细胞表达成肌纤维细胞标记物并导致视网膜收缩，还需要进一步探索。总体而言，这项研究为 PVR 的研究开辟了新道路，让人们对 PVR 的发病机制有了更深入的理解，为未来开发更有效的治疗方法奠定了坚实基础。相信在这个研究的基础上，未来会有更多针对 PVR 的研究取得突破，为广大患者带来新的希望。