基于粗裂解液和 ddPCR 对有限样本中稀有基因靶点的绝对定量研究

《Scientific Reports》：Absolute quantification of rare gene targets in limited samples using crude lysate and ddPCR

为解决从有限临床样本中定量稀有基因的难题，研究人员开发粗裂解液 ddPCR 法，该方法准确敏感，意义重大。

　　在生命科学研究的微观世界里，基因的精确量化就像一把精准的 “尺子”，衡量着生物进程的奥秘。从珍贵的临床样本中准确量化稀有基因，对科研和临床诊断都至关重要。然而现有的商业化基因组 DNA（gDNA）提取试剂盒，大多需要通过硅胶柱、磁珠或乙醇沉淀进行 DNA 纯化，虽然是很多研究人员的首选，但这些试剂盒对细胞数量有最低要求，以保证最佳的 DNA 质量和产量 。当面对细胞数量有限的临床样本时，它们就显得 “力不从心”，容易导致目标基因的丢失，使研究结果出现偏差。

为了攻克这一难题，来自英国帝国理工学院传染病系和大奥蒙德街儿童医院血液科的研究人员展开了深入探索。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为稀有基因的研究开辟了新道路。

研究人员开展的是一项关于开发和验证一种新型粗裂解液方法的研究，旨在实现对稀有基因，特别是 T 细胞受体切除环（TRECs）的绝对定量。TRECs 是 T 细胞在胸腺中进行 T 细胞受体基因重组时形成的小的染色体外 DNA 环1。TRECs 在有丝分裂期间不会复制，随着细胞分裂在细胞群体中逐渐稀释。因此，测量 TRECs 可以用来量化胸腺输出和细胞分裂历史，在新生儿严重联合免疫缺陷的筛查项目中发挥着重要作用。但由于低频记忆 T 细胞亚群（如 T 干细胞记忆细胞，仅占血液中 CD4?和 CD8?T 细胞总数的 2 - 4%）或抗原特异性 T 细胞（在无急性感染情况下，每 100 - 10?个 T 细胞中才有 1 个）中的 TRECs 浓度极低，加上起始细胞数量少，对其进行定量困难重重12。

在这项研究中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，通过密度梯度离心法从健康供体的外周血中分离出外周血单个核细胞（PBMCs），并进行相关处理和实验。其次，对比了多种细胞裂解液的制备方法，包括热裂解、超声处理、使用不同试剂盒的裂解缓冲液等。同时，利用液滴数字聚合酶链反应（ddPCR）技术对样本进行检测分析，在实验过程中设置多种对照，严格按照相关标准和流程进行操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。

下面来看具体的研究结果：

1. 优化和验证粗裂解液 ddPCR 检测方法：研究人员在多种制备细胞裂解液的方法中，发现 Ambion Cell to - Ct? 试剂盒（“Buffer 1”）和 SuperScript? IV CellsDirect? cDNA 合成试剂盒（“Buffer 2”）的裂解缓冲液最具潜力。添加创新的粘度降低（VB）步骤后，显著提高了实验的可靠性和准确性。因为细胞裂解液中完整的寡核苷酸会增加粘度，影响液滴形成和目标扩增，而 VB 步骤能有效解决这一问题34。
2. 液滴体积：通过光学显微镜观察发现，使用粗裂解液和提取 DNA 产生的液滴体积相似，且粗裂解液似乎减少了液滴体积的变异性。这一结果为后续实验中液滴体积的确定提供了重要依据，研究人员最终在计算中采用 0.70nL 作为液滴体积56。
3. 检测方法的线性和准确性：使用 Buffer 1 和 Buffer 2 制备的粗裂解液 ddPCR 检测方法均显示出良好的线性关系。其中，Buffer 2 表现更为出色，其检测 TRECs 的线性回归方程梯度与 1 无显著差异，能够更准确地反映 TRECs 的真实含量78。
4. 空白限、检测限和定量限：粗裂解液 ddPCR 检测方法的空白限（LOB）估计为零，检测限（LOD）＜0.0001 TREC / 细胞，定量限（LOQ）＜0.0003 TRECs / 细胞。与标准 ddPCR 相比，新方法在检测低浓度 TRECs 时更具优势，能够检测到更低浓度的目标基因912。
5. 批内重复性：对 8 个样本进行重复检测，计算 TREC 拷贝数 / 反应的变异系数（CV），平均值为 25%。虽然存在一定的变异性，但该结果仍在可接受范围内，表明该检测方法具有一定的稳定性10。
6. 与标准 ddPCR 的直接比较：通过对真实样本的分析，新开发的粗裂解液 ddPCR 与标准 ddPCR 检测的平均 TREC 拷贝数 / 细胞无显著差异。Bland - Altman 分析显示，标准 ddPCR 倾向于略微低估 TREC 拷贝数，且粗裂解液 ddPCR 在检测 TRECs 方面更具优势1113。
7. 细胞固定和透化的影响：研究发现，固定和透化细胞对 TRECs 定量的影响不大，但固定细胞中的 TREC 计数在高浓度样本中倾向于低于非固定细胞。这表明在将该方法应用于固定和透化样本时，可能还需要进一步优化14。

综合研究结果，研究人员开发的基于粗裂解液的 ddPCR 新方法，在从有限样本中定量稀有基因方面表现出色。该方法无需进行 DNA 提取，避免了传统提取方法中可能出现的目标基因丢失问题，大大降低了实验操作的复杂性。同时，新方法具有较高的准确性、敏感性和重复性，能够在极少量细胞样本中精准检测稀有基因靶点。这一成果在多个领域具有重要意义，如循环肿瘤细胞的检测、母体血浆中胎儿 DNA 的分析、稀有基因突变的研究以及珍贵临床样本的分析等，为生命科学研究和临床诊断提供了强大而有效的工具，有助于推动相关领域的进一步发展。