多组学分析揭示鼻咽癌及其癌干细胞异常 DNA 甲基化模式与相关生物标志物，助力精准诊疗

《Scientific Reports》：Multi-omic analyses reveal aberrant DNA methylation patterns and the associated biomarkers of nasopharyngeal carcinoma and its cancer stem cells

为探究鼻咽癌（NPC）及其癌干细胞（CSCs）的 DNA 甲基化模式，研究人员开展多组学分析，发现相关生物标志物，为精准诊疗提供新方向。

　　在医学领域，鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma，NPC）是一种发生于鼻咽上皮的恶性肿瘤，具有独特的地域和种族分布特点，在东亚和东南亚地区发病率较高。早期鼻咽癌相对容易治愈，但遗憾的是，超过半数的鼻咽癌患者在流行地区确诊时已处于晚期，预后较差。Epstein-Barr 病毒（EBV）感染在鼻咽癌的发展中起着关键作用，此外，遗传、种族和环境因素也与鼻咽癌的发病机制相关。

癌干细胞（Cancer Stem Cells，CSCs）是具有干细胞样特性的癌细胞群体，在多种癌症中都有发现，包括乳腺癌、肺癌、肝癌和结肠癌等，在鼻咽癌中也不例外。CSCs 具有更高的致瘤、转移和复发潜力，对治疗的耐受性更强，是导致鼻咽癌患者死亡的重要原因。

DNA 甲基化作为一种重要的表观遗传过程，能够调节基因表达。异常的 DNA 甲基化（低甲基化和高甲基化）是癌症的标志之一，与鼻咽癌的发生发展密切相关，同时也为癌症的诊断、预后评估和治疗提供了潜在的生物标志物和靶点。然而，目前对于鼻咽癌，尤其是其癌干细胞中的异常 DNA 甲基化模式及其潜在意义了解有限，已发现的异常甲基化生物标志物数量较少，这严重制约了鼻咽癌精准诊疗方案的发展。

为了深入探究这些问题，深圳湾实验室和清华大学深圳国际研究生院等机构的研究人员开展了相关研究。研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。在细胞培养方面，培养了 CNE2、C666-1 等 NPC 细胞系及其对应的 CSCs，以及正常的鼻咽上皮细胞 NP69。通过提取这些细胞的基因组 DNA 和 RNA，分别进行 DNA 甲基化分析和 RNA 测序。利用 Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip 芯片对 DNA 进行处理，识别差异甲基化的 CpG 位点（Differentially Methylated CpG Sites，DMCs）；通过 RNA 测序分析差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs），并进行 KEGG 和 GO 富集分析。此外，还利用单细胞核 RNA 测序（Single-Nucleus RNA-seq）验证相关生物标志物在单细胞水平的表达情况。

研究结果如下：

1. NPC 细胞和 NPC CSCs 的差异 DNA 甲基化：与正常鼻咽上皮细胞 NP69 相比，NPC 细胞（CNE2 和 C666-1）及其对应的 CSCs（CNE2 CSCs 和 C666-1 CSCs）的 DNA 存在异常甲基化，且呈现出不同的甲基化模式。CNE2 和 CNE2 CSCs 有更多低甲基化的 CpG 位点，而 C666-1 和 C666-1 CSCs 的差异甲基化 CpG 位点则以高甲基化为主。差异甲基化发生在 NPC 细胞和 NPC CSCs 的所有染色体上，DMCs 主要分布在基因体、基因间区域和启动子区域。
2. NPC 细胞和 NPC CSCs 的差异表达基因：NPC 细胞和 NPC CSCs 中的基因存在异常表达。C666-1 和 C666-1 CSCs 中上调的基因富集在更多的致癌通路中，如 TNF 和 NF-κB 通路，这与 EBV 感染的 NPC 特征相符。同时，C666-1 CSCs 中上调的基因还涉及免疫反应、抗原呈递等过程，且能招募和耗尽 T 细胞以及其他免疫抑制细胞，具有独特的免疫特征。此外，CNE2 CSCs 和 C666-1 CSCs 分别在上皮 - 间质转化（EMT）和 IFN-γ 反应方面高度富集，与 NPC 肿瘤的转移途径和对治疗的反应相关。
3. DNA 甲基化对 NPC 细胞和 NPC CSCs 基因表达的影响：启动子区域的高甲基化会抑制肿瘤抑制基因（Tumor Suppressor Genes，TSGs）的表达，C666-1 和 C666-1 CSCs 中启动子高甲基化的 TSGs 数量多于 CNE2 和 CNE2 CSCs。基因体的甲基化则与基因表达呈正相关，C666-1 和 C666-1 CSCs 中基因体高甲基化的上调基因和癌基因数量更多。KEGG 和 GO 分析表明，PI3K-Akt、Hippo、MAPK 等通路在 NPC 的发生发展中起重要作用，且许多关键基因受转录因子调控，与异常 DNA 甲基化密切相关。
4. NPC 特异性 DNA 甲基化生物标志物的鉴定：研究人员通过泛癌筛选，确定了 197 个 NPC 特异性的 CpG 位点，其中 9 个可作为潜在的诊断标志物。这些标志物在 NPC 患者中的甲基化水平显著高于正常组织和其他癌症。例如，位于 TGM2 和 AMIGO2 启动子区域的 CpG 位点，其甲基化与 NPC 患者的不良预后相关；位于 SHH 基因体的 cg11623714，在 NPC CSCs 中高度甲基化，可作为 NPC CSCs 的良好标志物。
5. 与异常 DNA 甲基化相关的潜在预后生物标志物的鉴定：研究人员进一步通过生存分析，确定了 12 个潜在的预后生物标志物，如 AUTS2、DNAH17 等。这些标志物在 NPC 患者中的甲基化水平和表达水平显著高于正常组织，且与患者的不良预后相关。其中，DNAH17 在 NPC CSCs 中高表达，具有作为 NPC CSCs 预后生物标志物的潜力。

研究结论和讨论部分指出，该研究不仅鉴定出了新的潜在诊断和预后生物标志物，还揭示了异常 DNA 甲基化与 NPC 发生发展、转移、免疫治疗反应和放疗抵抗之间的潜在关系。这些发现为深入理解 NPC 的发病机制提供了新的视角，有助于开发更精准的诊断和治疗方案。然而，研究也存在一定的局限性，如 DNA 甲基化检测使用的芯片与公共数据集不同，可能遗漏部分潜在的 NPC 特异性 CpG 位点。未来需要进一步研究这些生物标志物在临床实践中的应用价值，以及探索针对异常 DNA 甲基化的治疗策略，为鼻咽癌患者带来更多的希望。