综述：基于 CRISPR 的生物传感器在人乳头瘤病毒检测中的应用

《BMEF (BME Frontiers)》：Application of CRISPR-Cas System in Human Papillomavirus Detection Using Biosensor Devices and Point-of-Care Technologies

本文综述了 CRISPR-Cas 系统在 HPV 检测中的机制、应用及挑战，展现其在该领域的潜力。

　　

人乳头瘤病毒（HPV）感染现状与检测需求

HPV 是生殖道感染的常见病毒，也是引发性传播疾病的主要病原体之一。在全球范围内，相当比例的性活跃人群在一生中可能感染 HPV，部分感染虽可自行清除，但高危型 HPV（HR-HPV）持续感染与多种癌症的发生密切相关。其中，宫颈癌约 99% 由 HPV 感染引起，是女性第四大常见癌症 。在男性中，HPV 感染也较为普遍，近三分之一的男性感染至少一种生殖器 HPV 类型，约五分之一感染 HR-HPV 类型。

目前，HPV 检测对于宫颈癌的筛查和防治至关重要。传统的宫颈细胞涂片检测灵敏度低，难以在资源有限地区实施。分子检测方法虽广泛应用，但存在操作复杂、耗时久、成本高等问题。因此，开发快速、低成本且高灵敏度的现场即时检测（POCT）方法迫在眉睫。

CRISPR-Cas 系统的特点与分类

CRISPR-Cas 系统作为微生物的适应性免疫系统，具有强大的基因编辑、调控和检测能力，在基础和应用研究中广泛应用。该系统由 CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）和 Cas 蛋白组成。根据效应蛋白的数量和功能，Cas 蛋白可分为 2 大类 6 种类型。

其中，第 2 类系统结构简单，包含单一的多结构域蛋白，具备高效的基因编辑功能，在基因工程和诊断领域应用广泛。常见的 Cas 蛋白酶如 Cas9、Cas12a/b、Cas13、Cas14 等属于第 2 类系统。不同 Cas 蛋白酶的核酸检测机制各异，Cas9 通过特定的向导 RNA（gRNA）识别靶序列；Cas12、Cas13 和 Cas14 则利用其附带切割活性，在与 gRNA 和靶序列结合形成效应复合物后，切割标记的单链 DNA（ssDNA）或单链 RNA（ssRNA）报告基因，释放信号实现检测。

CRISPR-Cas 系统在 HPV 检测中的应用

1. CRISPR-Cas12 系统：Cas12 是第 2 类靶向系统，除了对双链 DNA（dsDNA）进行顺式切割产生粘性末端外，还对 ssDNA 具有附带切割活性。Cas12a 是 Cas12 家族中最常见的成员，其激活仅需 crRNA 引导识别靶标。Cas12 蛋白与 crRNA 和靶 DNA 结合形成复合物，激活蛋白酶活性，切割靶标并对非靶 ssDNA 进行附带切割，这一特性使其在核酸诊断的信号放大中极具潜力。
2. CRISPR-Cas9 系统：CRISPR-Cas9 系统利用 Cas9 与 tracrRNA 和 crRNA 识别靶标并编辑靶基因。Cas9 识别原间隔相邻基序（PAM）并切割靶 DNA，产生平端。该系统具有高度特异性，能区分单碱基错配。
3. CRISPR-Cas13 系统：CRISPR-Cas13 系统属于第 2 类 CRISPR 系统，专门靶向单链 RNA（ssRNA）。Cas13 包含 RNA 识别结构域（HEPN 结构域）和 crRNA 结合结构域，激活后会发生构象变化，对周围非靶 RNA 分子进行附带切割。基于 Cas13 的检测平台如 SHERLOCK，结合等温扩增技术，可实现飞摩尔级别的灵敏度，在 RNA 病毒检测、单核苷酸多态性（SNP）区分和实时荧光读数等方面具有优势。

CRISPR-Cas12 系统检测 HPV 的策略与平台

1. 核酸预扩增：CRISPR-Cas12a 检测常与核酸预扩增方法结合，以提高灵敏度。由于实际检测中目标 DNA 浓度低，需指数扩增以产生足够浓度的目标物。常见的扩增方法包括重组酶聚合酶扩增（RPA）、滚环扩增（RCA）、环介导等温扩增（LAMP）、聚合酶链反应（PCR）等。选择等温扩增方法时需考虑与 CRISPR-Cas12a 的反应条件兼容性，一步法和两步法各有优缺点，需平衡扩增反应和 CRISPR 切割反应。
2. 与生物传感器读出系统结合：生物传感器是检测分析物的重要工具，将生物元件与物理化学传感器结合用于测量。CRISPR-Cas12a 与多种读出方法（如电化学、光化学、比色、荧光、侧向流动分析等）结合，开发出多种检测 HPV 的生物传感器平台。
3. POCT 在 HPV 检测中的应用：POCT 是在患者床边进行的快速便捷临床检测，无需专业技术人员操作。CRISPR - 基于的生物传感器在 HPV 检测的 POCT 应用中发挥重要作用，开发了多种便携式检测平台，如 hippo - CORDS、SPEEDi - CRISPR、PddCas、CLIPON 等，这些平台为 HPV 的现场检测提供了更便捷的选择。

总结与展望

CRISPR/Cas 系统在 HPV 核酸诊断中展现出巨大潜力，有望开发出超灵敏、低成本、快速的非实验室检测试剂盒，改善现有诊断工具，促进 HPV 感染的早期筛查，降低宫颈癌发病率。然而，目前基于 CRISPR 的 HPV 核酸检测仍处于早期发展阶段，面临诸多挑战。标本采集困难，依赖临床医生经验，理想标本获取也存在问题；当前检测主要针对高危型 HPV，对多种同源性高的 HPV 类型实现单分子水平的灵敏准确检测至关重要；实验条件要求严格，试剂需低温保存，解决室温下核酸试剂的存储、运输和使用问题迫在眉睫；临床 HPV 感染复杂多样，现有检测多针对 1 - 2 种 HPV，开发微样本多重 HPV 检测并能分型的方法具有重要临床意义；优化和简化 CRISPR 诊断流程是从实验室走向临床的关键，需在不降低灵敏度的前提下避免核酸扩增带来的问题。尽管面临挑战，但 CRISPR 技术为 HPV 诊断带来了新机遇，有望在资源受限地区实现 HPV 的快速精准诊断，推动全球宫颈癌防控工作的发展。