Multiplexed proteomic biosensor 平台：实现无标记实时高通量蛋白互作筛选

《Communications Biology》：Multiplexed proteomic biosensor platform for label-free real-time simultaneous kinetic screening of thousands of protein interactions

为解决现有蛋白互作研究方法的局限，研究人员开发 SPOC 平台，可高通量筛选蛋白互作，助力科研与临床。

　　在细胞复杂环境中，蛋白相互作用对众多生物功能至关重要，其独特的结合亲和力由自由和结合复合物之间的动态平衡决定。因此，测量蛋白与其他生物分子相互作用的动力学参数，对于生物相互作用的功能表征、开发更有效的药物和疫苗，以及发现新的生物标志物和表型意义重大。

然而，目前用于研究蛋白相互作用的方法存在诸多问题。传统方法在生产功能性蛋白文库时，成本高昂、耗时久，且缺乏实时动力学筛选能力。例如，基于细胞或细胞无 cell-free 系统表达重组蛋白，再进行纯化和点样的方式，不仅繁琐、昂贵，还难以保持蛋白的稳定性，在大规模筛选时成本剧增。荧光蛋白微阵列虽常用于蛋白研究，但主要适用于定性和半定量分析，无法提供动力学分析所需的定量数据。表面等离子共振（SPR）技术虽能提供实时、无标记的定量数据，但设备昂贵，且通量有限。

为了攻克这些难题，来自 SPOC Proteomics, Inc. 的研究人员开展了一项极具意义的研究，开发出了名为 Sensor-Integrated Proteome On Chip（SPOC?）的自动化平台。该研究成果发表在《Communications Biology》上，为蛋白互作研究带来了新的突破。

研究人员在研究中主要运用了以下关键技术方法：
一是细胞无 cell-free 表达技术，利用人源细胞无 cell-free 体外转录和翻译（IVTT）裂解液，在纳米孔中直接表达蛋白，实现了从定制 DNA 文库到蛋白的快速生产。
二是 SPR 技术，与 SPOC 平台相结合，用于对蛋白芯片进行无标记的实时分析，获取蛋白相互作用的动力学数据。
三是定制的 AutoCap 仪器，自动化完成蛋白芯片的制作过程，从纳米孔玻片上的蛋白表达，到将蛋白捕获纯化到生物传感器芯片上，极大地提高了实验效率。

下面来看具体的研究结果：

1. 高通量生产蛋白：研究人员成功在 SPOC 生物传感器芯片上实现了原位表达和同时捕获蛋白。通过在纳米孔中固定质粒 DNA，利用 IVTT 裂解液表达蛋白，并将其捕获到功能化的生物传感器芯片上，形成了功能性蛋白阵列。AutoCap 仪器可同时处理多个纳米孔玻片，一次运行能产生多达 16 个 SPOC 芯片，且成本比传统方法降低了 10 - 100 倍。
2. 功能验证：使用定制的 Carterra LSAXT SPR 仪器对高密度 SPOC 阵列进行功能验证。结果表明，SPOC 蛋白生物传感器在 SPR 实验中可重复使用，能在不损失生物传感器和蛋白完整性的情况下进行多次样品注射和动力学筛选。此外，蛋白特异性抗体能与 SPOC 阵列上的相应蛋白高特异性结合，验证了该平台在高通量检测多个蛋白的能力，并能提供初步的动力学信息。
3. 抗体结合动力学分析：对比了二价和单价抗体在 SPOC 生物传感器上的结合动力学。发现二价抗体的结合受亲和力影响，会偏离 1:1 结合模型；而单价抗体能反映真实的结合亲和力，1:1 结合模型拟合良好。这表明 SPOC 平台在测量单价分析物的真实内在亲和力方面具有优势，在分析二价分析物时需谨慎考虑亲和力的影响。
4. 不同加载水平的影响：研究发现，SPOC 平台获得的结合动力学与蛋白在芯片上的展示水平无关。通过对不同密度捕获的 p53 蛋白进行动力学滴定实验，发现尽管不同加载水平下的最大响应（Rmax?）值差异显著，但结合速率（ka?）和解离常数（KD?）保持一致。
5. 交叉反应性：超高密度的 SPOC 生物传感器在相邻蛋白点之间表现出零交叉反应。通过对含有多种 p53 和 Src 蛋白点的 30k SPOC 芯片进行检测，用相应抗体探测时，仅目标蛋白点有反应，周围对照点无反应，证明了该平台的高特异性。
6. 其他验证：使用 Horiba OpenPleX SPRi 仪器对 SPOC 蛋白生物传感器进行分析，同样验证了其高度特异性检测蛋白的能力，且能检测蛋白的翻译后修饰。此外，在玻璃片上制备的 SPOC 蛋白阵列也通过正交免疫荧光验证了其功能，包括蛋白表达、捕获、与特异性抗体结合、酶活性以及蛋白 - 蛋白相互作用等方面的功能。
7. 药物筛选应用：利用 SPOC 平台对 SARS-CoV-2 Spike RBD 变体进行药物筛选，研究不同批次的商业抗 RBD 抗体与 RBD 变体的结合动力学差异。结果显示，SPOC 平台能检测到荧光检测无法发现的结合，并揭示出不同变体与抗体的结合动力学差异，以及不同批次抗体的亲和力差异，体现了该平台在评估抗体产品批次间差异的潜力。

研究结论与讨论部分指出，SPOC 平台是一种首创的用于生物传感器上高通量蛋白质组动力学分析的平台，能提供实时、无标记的定量、定性和动力学亲和力数据。该平台具有快速定制、包含折叠的全长蛋白、成本低等优势，可加速蛋白质组动力学研究流程。在未来，它有望广泛应用于单克隆抗体表征、人工智能设计药物验证、临床前药物开发等领域，对基础蛋白 - 蛋白相互作用动力学研究、疫苗功效监测、血清分析、生物标志物发现和诊断等方面也具有重要意义，为生命科学和健康医学领域的研究带来了新的契机和有力工具。